[发明专利]一种大规模哺乳动物工程细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够应用于工业化的大规模工程细胞培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

目前用于制备基因工程药物的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统主要指大肠杆菌表达系统，它具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度培养、成本低等优点，往往成为表达抗体片段以及表达产物翻译后修饰的又不影响功能和活性的蛋白类药物的首选表达系统。但对于抗体和糖蛋白类生物药物来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化的有无、以及糖基化的类型常常影响表达产物的合成、分泌、生物活性、体内稳定性以及免疫原性等特性；而原核细胞缺少内质网和高尔基体等可用于进行糖基化的结构和机制，所表达的产物是非糖基化的，且常常以包涵体的形式存在，因此大肠杆菌表达系统不适于表达全抗体和糖蛋白类药物。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫及植物、哺乳动物细胞【如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞】等真核细胞表达系统。其中酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但其糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞糖基化的方式是不一样的。与其它真核细胞表达系统相比，目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，并且哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到2000L以上，因此在表达这一类蛋白药物时人们往往首选哺乳动物细胞表达系统。与大肠杆菌表达系统相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高，因此建立哺乳动物细胞高效表达系统以及高表达工程细胞株的获得，是基因工程药物研究和生产的瓶颈，参见张国强等，生物技术通讯，Vol.16N0.1Jan.,2005。

近年来，为了提高蛋白质类药物的表达水平、降低生产成本，主要从表达载体的构建、宿主细胞的驯化、培养工艺的优化三方面对哺乳动物细胞表达进行优化。通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体，与此同时，研究者也对宿主细胞进行了多方面的改造，使之能更好地适应工业化大规模培养的要求，从而降低细胞培养和产品纯化的成本。

在细胞工艺优化方面，当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势的是悬浮细胞培养工艺。典型的悬浮细胞培养工艺包括细胞复苏、扩培和生产。一般从复苏工作细胞库细胞开始，经过不同规模的细胞培养罐逐级扩培，转入生产细胞罐，在生产罐中继续生长和表达产品。为了提高产量，通常需要在细胞罐中维持高密度和高活力的细胞。补料分批培养和灌注连续培养是经常用到的两种细胞培养工艺，补料分批培养工艺是间歇或连续向细胞罐内添加浓缩的培养基或营养成分，直至批次培养结束对产物进行收集纯化，工艺规模容易放大，操作简便，具有较高的体积产率。典型的补料分批培养工艺中，扩培罐中的培养时间一般为2-3天，生产细胞罐的培养时间一般在15天左右。生产罐中培养的15天中，扩培罐处于闲置状态，漫长的生产罐培养时间是影响设备使用率、影响生产周期的限制性步骤，同时较长的生产周期也大大增大了污染的风险，增大了生产操作的压力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种能够应用于工业化的大规模动物工程细胞培养方法，解决了细胞培养工艺过程中培养时间长、设备利用率低、易污染等技术难题。

术语说明：

本发明将进入生产罐之前的培养罐定义为扩培罐；扩培是细胞扩大培养的通用简称；

5%CO₂：是指CO₂体积浓度为5%；

溶氧（DO）%：是指体系中氧的溶量体积比；

CD Forti CHO培养基：是一种商品化的基础培养基的名称；

CD CHO培养基：是一种化学成分确定的无蛋白培养基，适合悬浮培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的生长和重组蛋白的表达；

补料培养基Feed C：是一种商品化的补料培养基的名称；

L-Gln：L-谷氨酸酰胺；MTX：氨甲喋呤；

G418：一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。

细胞对数生长期：指细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而快速生长的时期，此时期营养充足，细胞会以对数生长，N为细胞的分裂次数，细胞以2的N次方的速度生长(假如原来只有一个细胞，进入对数期以后就会变为两个，两个再变为四个)。