[发明专利]PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测技术领域，具体涉及一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒及方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的全球范围内严重危害养猪业的传染病。1987年首先在美国发现该病，以各年龄段母猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征症状的传染性疾病在美国和加拿大地区发现，并迅速向世界各地蔓延；1996年我国首次分离出PRRSV，2006年高致病性猪繁殖与呼吸综合(HP-PRRS)大范围爆发，给我国养殖业带来巨大损失，PRRS的监测和防控成为重要课题。目前，猪繁殖与呼吸综合征流行毒株包括PRRS经典毒株、PRRS经典疫苗株、PRRS高致病性毒株、PRRS高致病性疫苗株等，众多毒株并存使我们对该病监测的难度加大。该病的流行特点及其病原特性决定其高度传染性，疫苗是目前预防该病的主要手段。国内使用的疫苗主要包括弱毒疫苗和灭活疫苗，其中弱毒疫苗由于其具有抗体产生快、持续时间长和保护力强等特点，在临床上被广泛使用于控制PRRS的流行，但传统的弱毒疫苗在抗体监测过程中无法区分野毒和疫苗毒感染。基于此，本实验室在PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株反向遗传平台的基础上，将NSP2的复制非必须区域(Δ508-532)进行缺失，同时在该区域插入新城疫病毒NP蛋白末端49个氨基酸(NP49)作为标记，成功构建了双标记基因工程弱毒疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)，该疫苗株由于具备缺失和插入正、负双标记，这就为特异性区分野毒感染和实现PRRS有效防控奠定了坚实基础。

发明内容

本发明要解决目前由于众多种类PRRS疫苗的广泛使用，加大了对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染鉴别诊断难度的技术问题，提供一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，该试剂盒以基因工程标记疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)的特征缺失的25个氨基酸(25aa)作为包被抗原，不仅能有效区分传统PRRS疫苗免疫与标记疫苗免疫猪的血清抗体，而且能有效区分出PRRSV基因标记疫苗株与自然感染毒株，其灵敏度高、特异性强、重复性好。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含25aa多肽抗原，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明采用特异性标记区域缺失的25个氨基酸(25aa)多肽作为包被抗原，保证抗原的特异性和纯度，避免了其他杂蛋白混杂存在干扰。而且25aa相对分子量小、结构简单，降低了与其他病毒细菌抗体交叉反应的可能性，该25aa合成肽抗原呈水溶性，可较好的包被于酶标板，操作省时方便。该25aa特异性多肽抗原不同于PRRSV全病毒抗原或高表达量的融合蛋白抗原，由于PRRSV感染猪产生的抗体大部分是针对N蛋白，血清样品中针对25aa多肽抗原的抗体相对较少，因此选择纯度高的25aa多肽作为包被抗原可以明显提高针对25aa抗体检测的敏感度和特异性。

所述试剂盒还包含ELISA酶标板、封闭液、血清稀释液、酶标二抗、显示液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清。

优选的，25aa多肽抗原的包被浓度为500ng/孔。

优选的，所述封闭液为5％重量浓度的脱脂乳。

优选的，所述血清稀释液为2％重量浓度的牛血清白蛋白；所述血清稀释液对血清的稀释度为1∶40。

优选的，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪抗体，其稀释度为1∶8000。

在本发明的另一方面，还提供了一种非诊断目的的PRRSV基因标记疫苗株ELISA鉴别方法，包括以下步骤：

用25aa多肽抗原包被ELISA酶标板，该25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

将待测血清与包被抗原作用后，依次加入酶标二抗、显色液和终止液；

利用酶标仪读取吸光度值OD₄₅₀nm，并按公式：S/P＝(待测血清样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)，计算待测血清样品的S/P值；

待测血清样品S/P值≥临界值的判为阳性，S/P值＜临界值的判为阴性，所述临界值是通过ROC统计学分析方法获得的当灵敏度和特异度数值之和最大时对应的S/P值。

所述待测血清的稀释度为1∶40。

在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备鉴别诊断PRRS基因工程标记疫苗免疫猪的产品中的应用。