[发明专利]一种蛋白质定量方法

权利要求书

1.一种蛋白质定量方法，其是使用pH选择性二甲基化标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法，包括：蛋白胰蛋白酶酶解产物在反相柱上于酸性条件下标记肽段末端氨基，反相柱上于碱性条件下标记肽段侧链氨基；将标记完成的肽段洗脱下来进行质谱分析，对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，使用mascot distiller软件对一级谱肽段定量、使用文献报道的“force-find”程序对二级谱肽段定量；结合一级谱信息和二级谱信息对蛋白进行定量分析。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，具体过程如下：将两份蛋白质样品分别采用胰蛋白酶酶切；酶解产物分别上样到两个C18反相捕集柱上，在酸性条件（pH2.8～3.2）下分别通入4%(v/v)的CH₂O和0.6M的NaBH₃CH（v/v=1:1）或4%(v/v)的CD₂O和4%(v/v)的NaBH₃CH（v/v=1:1），使肽段末端的氨基被二甲基化，标记完通入A相(2%ACN+0.1%FA+98%H2O)除去过量标记试剂；然后在碱性条件（pH7.5～8.0）分别通入4%(v/v)的CD₂O和0.6M的NaBH₃CH（v/v=1:1）或4%(v/v)的CH₂O和0.6M的NaBH₃CH（v/v=1:1）下对肽段侧链氨基进行二甲基化标记；标记完通入A相(2%ACN+0.1%FA+98%H₂O)除去过量标记试剂；通入B相(80%ACN+0.1%-5%FA+20%H₂O)将标记完成的肽段洗脱下来进行后续液质联用分析（液相色谱的分离梯度为90min，质谱采用HCD模式进行离子碎裂）；质谱分析所产生的.raw文件使用mascot distiller软件进行搜库分析，搜库结果中以精氨酸结尾的肽段直接使用mascot distiller软件进行定量；以赖氨酸结尾的肽段使用文献报道的“force-find”程序进行定量。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：在C18捕集柱（0.15mmi.d×50mm）上进行酸性条件下二甲基标记末端氨基时间为4-10min；碱性条件下二甲基标记侧链氨基的时间为15-20min。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：使用mascot distiller软件对以精氨酸结尾的肽段进行基于一级谱的定量，对mascot distiller软件所导出的肽段定量结果中，提取出以精氨酸结尾的肽段的结果。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：使用“force-find”程序对以赖氨酸结尾的肽段进行基于二级谱的定量，“force-find”程序是基于二级谱上成对的b,y离子的强度信息来进行定量的程序，成对数目4对或6对以上的肽段才给予报告。