[发明专利]一种蛋白质定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。

背景技术

定量分析蛋白质组的动态变化，是当前研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标的迫切需要。在过去的数十年中，基于稳定同位素标记和质谱的蛋白质组定量方法已逐渐取代传统的基于二维凝胶电泳的定量方法。根据用于定量的谱图的不同，可以将基于稳定同位素和质谱的蛋白质组定量方法分为基于一级质谱的定量方法和基于二级质谱的定量方法。

基于一级质谱的定量方法是通过比较来自不同样品的轻重标记肽段的一级质谱峰强度或者谱峰面积来获得蛋白的比值信息。它主要包括SILAC、酶促¹⁸O标记、ICAT以及二甲基化标记等方法。这些方法都存在如下缺点：1、一级质谱图充满了背景噪音及未归属的谱峰，它们会显著地降低信噪比并限制定量的精度和动态范围；2、来自不同样品的同一肽段经轻重标记后会在一级质谱上会出现成对的两个谱峰，这就大大增加了谱图的复杂程度（Anal Chem 2011;83:6026-33）。

相比基于一级质谱的定量方法，基于二级谱的定量方法很好的解决了上述问题，因为采用这种方法，来源于不同样品的轻重标记肽段在一级谱上质荷比相同，在二级谱上出现成对的碎片峰（Anal.Chem.2011,83,4775–4781）。

目前，基于二级谱的定量方法主要包括基于低质量端报告离子的iTraq、TMT等方法和基于b,y离子的IPTL、IVTAL、QITL等方法。其中基于b,y离子的方法由于使用的成对离子数更多因而准确度、精密度更好，是近两年兴起的一种受到广泛关注的定量方法。目前，这种方法主要还存在如下缺陷：首先，目前报道的基于b,y离子的二级谱定量方法操作步骤都比较繁琐；其次，目前报道的基于b,y离子的二级谱定量方法定量覆盖度都不高，且存在较严重的低估效应（Chem.Commun.,2012,48,6265-6267）。

针对基于b,y离子的二级谱定量方法存在的上述问题，我们开发了一种使用pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法。该方法通过优化现有文献报道的成本最低、且操作相对简单的pH选择性二甲基标记方法（Anal.Chem.,2013,85,2478–2485），并将一级二级谱的定量信息进行有机结合，显著降低了操作复杂程度、提高了定量的准确度、精密度和覆盖度。

发明内容

本发明发展了一种使用pH选择性二甲基标记和一级二级谱结合定量的蛋白质定量方法，其操作较为简单，标记效率高，标记选择性好，定量精密度、准确度、覆盖度高。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1、采用胰蛋白酶酶切蛋白样品，胰蛋白酶能酶切蛋白的精氨酸位点和赖氨酸位点，因此会产生以精氨酸和赖氨酸结尾的肽段。

2、将一份酶解后的蛋白样品上样至C18反相捕集柱上，于酸性条件下选择性的对肽段氨基端进行二甲基化标记；使用A相(2%ACN+0.1%FA+98%H₂O)冲洗捕集柱后用50mM的磷酸缓冲溶液平衡捕集柱；再于碱性条件下选择性的对酶解产生的赖氨酸上的侧链氨基进行二甲基化标记，最后使用A相(2%ACN+0.1%FA+98%H₂O)冲洗捕集柱。

3、重复上述步骤对另一份蛋白样品的酶解产物进行标记。

4、使用B相(80%ACN+0.1%-5%FA+20%H₂O)将标记后的两份蛋白样品洗脱收集下来，出盐蒸干后进行后续的质谱分析。

5、对质谱分析得到的结果文件进行数据库搜索，其中鉴定出的以赖氨酸结尾的肽段通过“force-find”程序进行基于二级谱的定量分析；鉴定出的以精氨酸结尾的肽段通过mascot distiller软件进行基于一级谱的定量分析。

本发明具有如下优点：

1、标记效率高，标记选择性好：使用优化的pH选择性二甲基标记方法，其肽段N端二甲基化和赖氨酸上氨基二甲基化的标记效率和标记选择性都能打到95%以上；

2、操作步骤简单：整个标记过程只需要进行两步较为简单的二甲基化标记，无须复杂的除盐蒸干等步骤；

3、定量精密度、准确度、覆盖度高：该方法在二级谱和一级谱的定量准确度、精密度上均与文献报道的结果相当，且由于能同时获得基于一级谱和二级谱的定量结果，通过将它们结合能获得更好的定量准确度、精密度以及覆盖度。

附图说明