[发明专利]一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法

权利要求书

1.一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，包括以下步骤：

1）早金甜橙无菌苗准备：

早金甜橙果实中取出种子，自来水冲洗后于1M NaOH溶液中浸泡10min，流水冲洗去除果胶；采用3％ v/v的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，剥去内外种皮后播种于MT播种培养基上，24-26℃暗培养4四周后，取出1500－2000lx光照5－7天，待稍转绿后挑选健壮无菌苗用于转化；

2）.发根农杆菌菌液准备：

取-80℃保存的发根农杆菌MSU440菌株在LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养36－48h获得活化单菌落，挑取活化的发根农杆菌单菌落，LB固体培养基上再次划线，28℃暗培养36－48h，刮取培养好的菌体于MT悬浮培养基中，180rpm、28℃振荡培养1.5－2h后将菌液OD₆₀₀值调至0.6－0.8后待用；

3）外植体侵染与毛状根诱导：

切取上胚轴切段在农杆菌菌液中侵染20-30min，灭菌滤纸上吸干，转至MT共培养基上，21℃暗处共培养3d，将外植体用无菌水漂洗3次，滤纸吸干后转接于含400μg/L头孢霉素的MT基本培养基上24-26℃暗处诱导毛状根并除菌；

4）毛状根继代培养：

毛状根伸长至2cm时，切下1-1.5cm带根尖切段继代至含400mg/L头孢霉素的MT基本培养基上，20d继代1次，24-26℃ 暗处连续继代培养2-3次；

5）毛状根生芽：

将毛状根切成1cm切段，转至生芽培养基上，24-26℃，每日16h 光照，1500－2000lx；8h暗处理条件下下诱导生芽；

6）再生芽伸长：

再生芽体生长至0.5－1cm时，转至芽伸长培养基；

7）再生芽生根：

芽体生长至1.5cm时，单独切离转至MT生根培养基诱导生根，两周可见切口发出不定根；

所述的培养基如下：

MT播种培养基：MT+25g/L 蔗糖+8g/L 琼脂；

MT悬浮培养基：MT+0.5g/L麦芽提取物+1.5g/L谷氨酰胺+40g/L蔗糖+20mg/L乙酰丁香酮；

MT共培养培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+20mg/L乙酰丁香酮；

毛状根诱导培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+400mg/L 头孢霉素；

毛状根生芽培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+1mg/L BA；

芽伸长培养基：MT+30g/L 蔗糖+8g/L琼脂+0.1mg/L BA+0.1mg/L IAA+0.25mg/L GA₃；

MT生根培养基：1/2MT+25g/L 蔗糖+8g/L琼脂+0.5mg/L NAA+0.1mg/L IBA+0.5g/L 活性炭；

LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L 。