[发明专利]一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法。

背景技术

柑橘是世界重要果树，具联合国粮农组织统计（FAO），2009年世界柑橘种植面积达到871.9万公顷，总产量约1.24亿吨；同期我国柑橘种植面积约为200万公顷，产量达0.25亿吨，均居世界第一位。然而，随着我国城镇化建设的发展，农村劳动力大量转移，柑橘生产劳动力成本提高，影响果农生产积极性；此外，橘园劳动者日趋老龄化，只有发展简化栽培的模式才适合农村柑橘产业发展。

培育矮化栽培品种，可方便果实采收及日常栽培管理，减少劳动强度，为柑橘简化栽培提高资源。发根农杆菌为革兰氏阴性菌，可通过侵染植物伤口将Ri质粒上T-DNA整合入宿主核基因组，并诱发毛状根的产生；由毛状根再生的植株通常具有节间短缩和植株矮化的表型，这在苹果砧木山定子的毛状根再生植株中已经得到证实（武姣等.2008.发根农杆菌介导山定子遗传转化及发根再生植株.园艺学报，35（7）：959－966.）。发根农杆菌应用于柑橘遗传改良的研究报道较少，利用发根农杆菌诱导柑橘产生毛状根，建立柑橘中毛状根植株再生方法，培育出矮化品种，可为新形势下农村柑橘生产简化栽培和省力栽培模式的发展提供品种资源上的支持。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法。本发明主要针对我国柑橘生产劳动力不足、劳动力成本较高，而柑橘价格却徘徊不前的现状，根据发根农杆菌转化再生的植株通常具备株型矮化的特点，提出利用发根农杆菌MSU440转化多胚品种早金甜橙，诱导出毛状根后通过毛状根生芽及再生芽生根途径获得完整再生植株，最终培育出适合省力栽培的矮化品种，从而提高了果园劳动效率，降低了劳动消耗。本发明转化受体材料为早金甜橙无菌苗上胚轴，由于甜橙为多胚品种，因此再生植株可以保留亲本的优良品质。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，包括以下步骤：

1.早金甜橙无菌苗准备：

早金甜橙果实中取出种子，自来水冲洗干净后于1M NaOH溶液中浸泡10min，流水冲洗去除果胶；采用3％（v/v）的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，剥去内外种皮后播种于MT播种培养基上，24-26℃暗培养4四周后，取出1500－2000lx光照5－7d，待稍转绿后挑选健壮无菌苗用于转化。

2.发根农杆菌菌液准备：

取-80℃保存的发根农杆菌MSU440菌株在LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养36－48h获得活化单菌落，挑取活化的发根农杆菌单菌落，LB固体培养基上再次划线，28℃暗培养36－48h，用手术刀片刮取培养好的菌体于MT悬浮培养基中，180rpm、28℃振荡培养1.5－2h后将菌液OD₆₀₀值调至0.6－0.8后待用。

3.外植体侵染与毛状根诱导：

切取上胚轴切段在农杆菌菌液中侵染20-30min，灭菌滤纸上吸干，转至MT共培养基上，21℃暗处共培养3d，将外植体用无菌水漂洗3次，滤纸吸干后转接于含400μg/L头孢霉素的MT基本培养基上24-26℃暗处诱导毛状根并除菌。本发明中毛状根诱导培养基中不添加激素。

4.毛状根继代培养：

毛状根伸长至2cm左右时，切下1-1.5cm带根尖切段继代至含400mg/L头孢霉素的MT基本培养基上，20d左右继代1次，24-26℃暗处连续继代培养2-3次后基本可脱除残留的农杆菌。

5.毛状根生芽：

将毛状根切成1cm左右切段，转至生芽培养基上，24-26℃，每日16h光照（1500－2000lx）8h暗处理条件下下诱导生芽。在生芽培养基上毛状根首先形成致密胚状体，之后发育出丛生芽。

6.再生芽伸长：

再生芽体生长至0.5－1cm时，转至芽伸长培养基上，以促进芽体的迅速伸长。

7.再生芽生根：

芽体生长至1.5cm左右时，单独切离转至MT生根培养基诱导生根。两周左右可见切口发出不定根。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：