[发明专利]检测阴道加德纳杆菌的引物、探针及方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学体外诊断试剂技术领域，特别是涉及用于检测阴道加德纳杆菌的引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行阴道加德纳杆菌检测的方法和试剂盒。 

背景技术

阴道加德纳杆菌（Gardnerella vaginalis，GV）是细菌性阴道病(Bacterial vaginosis，BV)的主要病原体，可经性接触传播。在BV患者和健康妇女中，阴道加德纳杆菌检出率存在显著差异，在BV的微生物菌群中GV处于优势地位，数量明显高于其他非正常菌群。细菌性阴道炎在妇科门诊中的患病率为18%-20%，发病率45%，居其他阴道炎之首。因此对于阴道加德纳杆菌的检测对于细菌性阴道炎的早期诊断、早期治疗以及预防控制等至关重要。 

    目前对阴道加德纳杆菌的实验室诊断主要有直接涂片革兰染色找线索细胞、细菌分离培养以及PCR等。直接涂片革兰染色找线索细胞和加德纳杆菌法，是临床最常见的检测方法，该方法同时可进行真菌和淋病等检测，是一种相对简便易行的常规方法，由于该方法误判率高、不能作为一种确诊方法，只能作为一种常规筛查。细菌分离培养法是检测GV的金标准，准确可靠，但其培养要求高，阳性检出率低，易受药物等环境因素的影响，且耗时长、花费大。普通PCR技术可以避免这一问题，但是存在灵敏度低、易污染造成假阳性等缺点，同时常规PCR专利已经失去保护，很难形成商品化试剂盒。 

 实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。目前国内尚无检测阴道加德纳杆菌的实时荧光PCR技术以及试剂盒的相关专利。 

发明内容

本发明的目的在于提供用于实时荧光PCR检测阴道加德纳杆菌的特异性引物和探针。 

本发明的另一个目的在于提供检测阴道加德纳杆菌的荧光定量PCR方法及其试剂盒。 

为了实现上述目的，本发明筛选出阴道加德纳杆菌的特异性序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。 

本发明提供用于检测阴道加德纳杆菌上述特异序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中，探针5’标记荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’标记淬灭基团为TAMRA、DABCYL或BHQ。该特异引物扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。 

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为： 

上游引物：CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT，

下游引物：TTCCGTGGCTAAGCGTGT；

探针序列为：FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA。

    本发明还保护上述引物和探针序列的互补核苷酸序列，或向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。 

    本发明提供一种阴道加德纳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，是以样品总DNA 为模板，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立标准品，根据扩增曲线判定结果。 

本发明的实时荧光定量PCR的反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为： 

。

本发明的实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。 

本发明提供了一种用于阴道加德纳杆菌检测的试剂盒，其包括上述能特异地扩增出如SEQ ID NO.9所示核苷酸序列或其特异性片段的引物以及配合引物使用的探针。 

本发明试剂盒所用引物序列为： 

上游引物：CTTTTCTCGGCAAGCAGGAT，

下游引物：TTCCGTGGCTAAGCGTGT；

探针序列为：FAM-CCTTACAGCCTACCCATCACGCCTCAGC-TAMRA。

    本发明提供的试剂盒，还包括标准品，所述标准品含有阴道加德纳杆菌基因组DNA。