[发明专利]一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂及检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：其主要组份及含量如下：

每100μl的检测试剂中：

基因重组GLP-1受体  20μg；

二肽基肽酶-4抑制剂  占血浆样本重量的1%；

三磷酸腺苷  480μg；

三磷酸鸟苷  10μg；

3-异丁基1-甲基黄嘌呤  0.5mg；

膜反应液  100μl。

2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的GLP-1受体的制备步骤如下：

⑴真核细胞GLP-1受体表达

①根据人GLP-1受体的序列设计引物，5′端引入BglII酶切位点和Kozok序列，3′端引入XhoI酶切位点和终止密码；5’端引物序列见序列1，3’端引物序列见序列2；

②用PCR方法扩增DNA片段，模板来自胎儿正常胰岛组织的cDNA文库，反应条件为：

94℃，30s；

60℃，20s；

72℃，90s；

25个循环后，72℃延伸7min；

③反应结束后，凝胶电泳提取PCR片段（1.4Kb），分别用BglII和XhoI消化PCR产物并用QIAGEN Plasmid Mini Kits纯化DNA片段；使用NheI和XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)(5.4kb)；

④按照DNA的重量比为1:5-10的比例将PCR片段和质粒片段在DNA连接酶的作用下连接起来，将新构建的质粒转入Ecoli DH5α细菌中；

⑤通过氨苄青霉素筛选步骤④中转入Ecoli DH5α的细菌，挑取单菌落，PCR鉴定后，提取纯化重组质粒；

⑥使用电穿孔将重组质料转染CHO细胞株，用G418筛选细胞株，扩增并提取蛋白质，确定该细胞株表达GLP-1受体，液氮冻存备用；

⑵提取表达GLP-1受体细胞膜的过程

①向洗涤细胞中加入harvesting缓冲液，在温箱中孵育后，离心，弃去上清液；

②将离心后的沉淀重新悬浮，将其在冰上孵育后破碎细胞，得细胞液；

③将步骤②中细胞液离心；将沉淀重新悬浮，再向其中加入蛋白质，最终调整为2mg/mL，即得GLP-1受体。

3.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的二肽基肽酶-4抑制剂为磷酸西他列汀。

4.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：

余量为双蒸水；

pH=7.4。

5.根据权利要求3所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂，其特征在于：所述的膜反应液的组成成份及重量份数g/L为：

余量为双蒸水；

pH=7.4。

6.一种胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1至5任一项所述的检测试剂。

7.一种如权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1生物学活性检测试剂的检测方法，其特征在于：步骤如下：

⑴加入GLP-1受体、膜反应液、待测标本及GLP-1标准品后，于30℃振荡下，孵育5-10min；同时设定自身对照；利用GLP-1系列标准品绘制标准曲线；

⑵吸取步骤⑴中反应液加入cAMP酶联免疫吸附试验试剂盒微孔板中，并向微孔板中加入样本稀释液及辣根过氧化物酶标记的检测抗体，使待检测的cAMP与酶标抗体结合；

其中，反应液体、样本稀释液和辣根过氧化物酶标记的检测抗体的体积比为：1：4：10。

⑶洗去未结合的酶标抗体后加入底物TMB显色，反应完成后，测定反应GLP-1的量；

其中，各物质的添加量均按照权利要求1的配比。