[发明专利]一种制备谷氨酸脱羧酶的方法

权利要求书

1.一种利用反胶团萃取体系制备谷氨酸脱羧酶的方法，步骤如下：

（1）将含谷氨酸脱羧酶的微生物细胞进行培养，得细胞培养液，离心，制得湿菌体细胞，将湿菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞悬浮液，破碎细胞，得到细胞破碎液；调细胞破碎液的pH值为5.5～7.0，然后加入无机盐调节溶液的离子强度为0.10～0.20mol/L，制得含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液；

（2）将助溶剂加入到有机溶剂中，助溶剂与有机溶剂的体积比为1:（4～10），摇匀，再加入表面活性剂，使表面活性剂在有机溶液中的浓度为100～250mmol/L，混合均匀，制得反胶团体系溶液；

将缓冲剂加入到去离子水中配制0.10～0.20mol/L的缓冲溶液，再将反萃取助剂加入到缓冲溶液中，使反萃取助剂在缓冲溶液中的质量浓度为5～30wt%，摇匀，然后加入无机盐调节溶液的离子强度为1.0～2.0mol/L，制得反萃取水相溶液；

（3）将步骤（1）制得的含有谷氨酸脱羧酶的细胞破碎溶液加入到步骤（2）制得的反胶团体系溶液中，反胶团体系溶液与细胞破碎溶液的体积比为1:（1～10），混合均匀，萃取操作温度为10～25℃，离心分相，取有机相，制得含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液；

（4）向步骤（3）制得的含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液中加入步骤（2）制得的反萃取水相溶液，反萃取水相溶液与含有谷氨酸脱羧酶的反胶团有机溶液的体积比为1:（1～10），混合均匀，反萃取操作温度为30～40℃，离心分相，制得含有谷氨酸脱羧酶的水溶液；

（5）将步骤（4）制得的含有谷氨酸脱羧酶的水溶液用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得谷氨酸脱羧酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的离心条件为3000～5000r/min、离心10～20min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的细胞悬浮液中的细胞质量百分比浓度为25～35%。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的破碎细胞采用高压细胞破碎机，操作压力为50～60MPa，操作温度为5～15℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的无机盐选自氯化钾或溴化钾。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的助溶剂选自正丁醇、正戊醇、己醇或庚醇之一。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的有机溶剂选自异辛烷、辛烷、正己烷或环己烷之一。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中表面活性剂为阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂组成的混合表面活性剂，两者的重量份配比为：阳离子型表面活性剂：非离子型表面活性剂=（1～5）:1，优选阳离子型表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），优选非离子型表面活性剂为失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80）。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的缓冲剂选自磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠或乙酸-乙酸钠之一；根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反萃取助剂选自乙醇、丙醇或异丙醇之一。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中的离心分相条件为3000～4000r/min、离心5～10min；根据本发明优选的，所述步骤（5）中的超滤膜工作压力为0.1～0.3MPa，膜的截留分子量为40000～50000Dal，操作温度为25℃。