[发明专利]一种制备谷氨酸脱羧酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备谷氨酸脱羧酶的方法，特别涉及利用反胶团萃取技术制备谷氨酸脱羧酶的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）是一种吡哆醛类裂解酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。谷氨酸脱羧酶是生物催化L-谷氨酸或其钠盐上的α-羧基进行脱羧反应生成γ-氨基丁酸和CO₂的唯一酶，它还极可能作为特定的诊断酶来预测和区分糖尿病以及作为极具潜力的诊疗型酶制剂。

谷氨酸脱羧酶所催化产生的γ-氨基丁酸具有降血压、增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定、促进生长激素分泌和保肝利肾等多种生理功能，在医药和保健食品中具有广泛的应用价值，已被我国卫生部列为“新资源食品”。因此，GAD用于医疗和食品具有很大的潜力。利用游离或固定化谷氨酸脱羧酶进行γ-氨基丁酸的生物制备日益得到重视，与细胞催化相比，可以避免细胞自身代谢产物对产品的污染、简化γ-氨基丁酸的分离纯化过程、降低生产成本，目前谷氨酸脱羧酶的生产和纯化逐渐形成产业，有很好的市场前景。

谷氨酸脱羧酶的生产主要采用微生物发酵法和植物提取法。植物提取法是从大豆、米糠、大米胚芽、玉米胚芽等中提取，由于植物中谷氨酸脱羧酶的含量较低，提取前常需要对其内源性酶进行激活，导致生产成本较高，不利于大规模生产。微生物发酵法是以葡萄糖为原料，通过培养具有高活性谷氨酸脱羧酶的微生物细胞如大肠杆菌、乳酸菌等获得，其具有原料来源广泛、发酵周期短、生产成本低、易于实现工业化的特点，是一种经济有效的生产方法。微生物发酵法制备谷氨酸脱羧酶的过程包括微生物细胞的培养和酶的分离纯化，在酶的生产成本构成中，分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比例，因此，如何采用高效的分离技术是谷氨酸脱羧酶生产中需要解决的技术问题。

目前，谷氨酸脱羧酶的分离纯化方法主要采用盐析法、离子交换法、凝胶色谱法等，如许建军（无锡轻工大学学报，2004.3）在进行谷氨酸脱羧酶酶学性质研究时，采用硫酸铵分级、DEAE-Sepharose CL-6B层析、Sephacryl S-200凝胶过滤等手段从乳酸菌细胞中分离纯化得到了收率为3.8%的纯谷氨酸脱羧酶。侯远策（黑龙江大学硕士论文，2011）在进行乳酸片球菌产谷氨酸脱羧酶的研究时，采用硫酸铵盐析、Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析对GAD进行了分离纯化，得到了收率为15.1％的纯谷氨酸脱羧酶。中国专利文献CN102367432A（申请号201110289796.3）采用镍柱亲和层析纯化方法获得谷氨酸脱羧酶。上述方法存在工艺复杂、生产周期较长、酶活力回收率低、不能连续生产等问题，从而导致了谷氨酸脱羧酶的生产成本较高。因此，改进现有生产技术以及开发新的生产技术以降低谷氨酸脱羧酶的生产成本势在必行。

反胶团萃取技术是一种新型的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。反胶团是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的、内含微小水滴的、空间尺度仅为纳米级的集合型胶体，反胶团的微小界面和微小水相具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能和在疏水性环境中使亲水性大分子保持活性的功能。反胶团在生物分离过程中具有以下突出的优点：有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；分离和浓缩可同时进行，过程简便；能解决生物活性物质在非细胞环境中迅速失活的问题；易于放大和实现工业化生产；溶剂可反复使用，萃取成本低等。

在生化分离工程中形成反胶团体系常用的表面活性剂有阴离子型表面活性剂如琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸纳（AOT）、阳离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）以及非离子型表面活性剂如失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span80），常用的非极性有机溶剂有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷等，常用的助溶剂有丁醇、戊醇、己醇等。CTAB是一种阳离子型表面活性剂，形成的反胶团体系适用于相对分子量较大的蛋白质的分离，而Span80是一种非离子型表面活性剂，当其与阳离子型表面活性剂混合在一起形成反胶团时，能增大反胶团的尺寸，使大分子蛋白质的溶解度增加，并且CTAB和Span80构成的反胶团体系对蛋白质还具有更高的分离效率；当在有机溶剂中加入己醇等助溶剂时，也可增大反胶团的尺寸，使大分子蛋白质的溶解度增加。CTAB与异辛烷等形成的反胶团体系在生化分离工程中应用较多，它们形成的反胶团体系结构简单而稳定，体积相对较大，适用于蛋白质、酶等大分子的分离。采用反胶团萃取技术可实现酶分子的分离纯化，其生产成本较低，并能实现连续生产，具有很好的工业应用前景。