[发明专利]一种噬菌体展示随机肽库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及生物制药技术范畴，特别涉及一种噬菌体展示随机肽库的构建方法。 

背景技术

噬菌体展示技术(phage display technology)是由Smith于1985年创建，于20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术。基本原理是噬菌体作为一种表达载体，可以将外源蛋白或多肽呈现在噬菌体表面，利用外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异性亲和作用，通过吸附-洗脱-扩增的筛选富集过程，将表达与药物特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集，然后通过测序分析即可得到与药物特异性结合的外源蛋白或多肽。目前该技术已经广泛应用于抗原表位的模拟和蛋白、核酸结合特性的研究，同时在药物筛选和疫苗研制方面也有广泛的应用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种噬菌体展示随机肽库的构建方法。其特征在于，所述噬菌体展示随机十五肽库的构建方法为： 

1载体(图1) 

采用噬菌粒pCANTAB5E(见图1)，pCANTAB5E含有SfiI和NotI两个酶切位点，可以将外源目的基因通过酶连反应重组进入噬菌粒载体。 

2文库构建 

构建文库多为6～16肽，我们选择构建15肽库，采用NNK编码方式，N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指导合成全部20种氨基酸。将编码随机肽库的两条链经退火、延伸补平、双酶切后，与经同样双酶切的5’去磷酸化载体连接，电转TG1感受态细胞。 

3随机肽库库容和多样性检验 

取1μl从平板上刮下来的TG1肽库菌液，梯度稀释后涂布SOB平板，计算库容。随机挑取20个克隆进行测序，对其多样性进行检验。 

本发明的有益效果是所构建的肽库为噬菌体展示随机肽库，噬菌体展示技术研发模式更高效，耗成本更低，并能定向设计出结构更优化的新药。对于药物与蛋白作用的研究，在病理学、药理学等诸多方面具有重要意义。利用噬菌体表面展示技术构建相应的蛋白质或多肽文库，以此导向、跟踪，从复杂提取物中找出有效部位或成分，再进行动物试验，可收到事半功倍的效果。 

附图说明

图1为pCANTAB5E载体的限制图谱和多克隆位点。 

图2为PCR扩增的编码15肽的双链DNA片段，图中M为DL2000，1为目的DNA片段。 

图3为PCR扩增的重组载体中的目的片段，图中M为DL2000，1～10为PCR扩增的结果。 

具体实施方式

本发明提供一种噬菌体展示随机肽库的构建方法，所述肽库的构建方法结合附图和实施过程以说明。 

1实验材料： 

E.coli TG1：由中国药科大学生物制药教研室保存，E.coli TG1：supE hsdΔ5thiΔ(lac-proAB)F’[traD36proAB+lacIq lacZΔM15]。 

噬菌粒pCANTAB5E，由中国药科大学生物制药教研室保存。 

DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Fermentas公司；碱性磷酸酶CIAP购自TaKaRa公司；限制性内切酶SfiI、NotI购自NEB公司。 

Plasmid Miniprep kit I，Gel/PCR Extraction kit购自Biomiga公司。 

2噬菌体展示随机十五肽库的构建 

2.1线性化载体的制备 

提取pCANTAN5E质粒，SfiI、NotI进行双酶切，利用Biomiga胶回收试剂盒回收酶切产物，CIAP酶进行去磷酸化处理。在Eppendorf管中加入适量酶切产物，缓冲液及CIAP酶，去离子水补充至50μl，混匀后37℃水浴30min，再50℃水浴30min，去磷酸化产物用PCR产物回收试剂盒进行纯化，去离子水洗脱后，-20℃。 

2.2编码15肽的随机DNA片段的制备 

根据载体上SfiI、NotI酶切位点情况及构建随机肽库的要求，设计两条寡核苷酸片段， 

链1：5′-GCTGGCCCAGCCGGCC(SfiI)(NNK)₁₅TAAGCGGCCGC