[发明专利]酮还原酶LEK、编码基因、突变体及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种酮还原酶及生物催化合成手性化学中间体的方法，特别是涉及来源于路德酵母的酮还原酶LEK及其突变株，以及该酮还原酶LEK或突变株能够选择性的还原底物，生成R型的CHBE，其e.e.值大于99％。

（二）背景技术

β羟基酯是医药、农药、材料及其它精细化工原料的重要组成部分，如4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE），是一种重要的有机合成的中间体，分子中有三个功能基团（-OH，-Cl，-COOH），可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。其手性单体（R/S）-CHBE都是非常有前景的手性物质。R-CHBE可以作为合成L-肉毒碱（Eui S C,Joo R E,Lee J K,Lee S H,Lee S G.Highly stereoselective formation of optically pure2,4-oxozolidinedione via diastereoselective dihodroxylation of(4S)-3-(CE)-3’-substituted-2’-propenoyl)-4-isopropopyl-2-oxazolidinone.Tetrahedron:Asymmetry,1995,6(4):871-872.），(-)-大内酰亚胺A（Marino J P,McClure M S,Holub D P,Comasseto J V,Tucci F C.Stereocontrolled synthesis of(-)-macrolactin A.J Am Chem Soc,2002,124(8):1664-1668.），R-γ-氨基-β-羟基丁酸（Kolb H C,Bennani Y L,Sharpless K B.Short and practiceal syntheses of(R)-(-)-amino-hydroxybutyric acid.Tetrahedron:Asymmetry,1993,4(1):133-141.）的关键中间体，还可以转化为负霉素（Davies S G,Ichihara O.Asymmetric synthesis of(+)-negamycin.Tetrahedron:Asymmetry,1996,7(7):1919-1922.）。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂（他汀类药物，2007年全球销售额达到160亿美金）和β-1,4-二氢吡啶类钙离子通道阻断剂（Kita K,Kataoka M,Shimizu S.Diversity of4-chloroacetoacetate ethyl ester-reducing enzymes in yeasts and their application to chiral alcohol synthesis.J Biosci Bioengi,1999,88(6):591-598.）等药物，具有重要的应用价值和广阔的市场。

目前以4-氯乙酰乙酸乙酯为原材料来制备CHBE主要有化学法（手性钌催化剂还原法）和生物催化法两种方法。化学不对称合成方法采用手性催化剂如2,2’-二联苯膦基-1,1’-联萘钌配合物(2,2’-bos(dipHenyIpHospHino)-1,1’-binapHthyl ruthenium complex)作为不对称还原催化剂，该方法反应条件苛刻，需使用高压氢，对反应器要求较高；反应须在高温下进行，能耗比较高；所用的含铑或钌的催化剂价格昂贵且不易获得，因此成本较高；同时由于以金属为催化剂，使得很多制备的药物中金属含量超标，达不到安全使用的标准，无形中增加了生产成本（Kitamura M,Ohkuma T,Takayaa H,Noyori R.A practical Asymmetric Synthesis of Carmtine.Tetrahedron Lett,1988,29(13):1555-1556.）。生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。生物不对称还原方法利用可以还原4-氯乙酰乙酸乙酯的重组酶，例如短链脱氢酶，酮还原酶等来不对称还原得到手性的4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

微生物是羰基还原酶和醇脱氢酶的好来源，大量的文献报道了微生物来源的酶法制备手性CHBE的情况。