[发明专利]一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞及其应用有效
| 申请号： | 201310251408.1 | 申请日： | 2013-06-24 |
| 公开（公告）号： | CN104232585B | 公开（公告）日： | 2018-06-22 |
| 发明（设计）人： | 丁长才;湛敏 | 申请（专利权）人： | 丁长才 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/864;A61K35/44;A61P39/06;A61P39/02 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 518055 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 金属硫蛋白基因 脐带间充质干细胞 携带 重组腺相关病毒 制备 重组腺相关病毒载体 衰老模型小鼠 模型小鼠 衰老进程 小鼠血 滴度 构建 小鼠 血铅 质粒 延缓 感染 应用 | ||
1.一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将人金属硫蛋白基因连接到腺相关病毒载体pAAV-MCS上，得到携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT，鉴定金属硫蛋白基因已连接到腺相关病毒载体上；
(2)利用磷酸钙共沉淀法将重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT、包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper共转染到AAV-293细胞中，培养至AAV-293细胞出现表型变化和毒性反应,完成重组腺相关病毒株rAAV-hMT的包装；
(3)收集细胞悬液，采用反复冻融方法，收集含有重组腺相关病毒株rAAV-hMT的上清液，纯化并测定rAAV-hMT毒株的滴度；
(4)重组腺相关病毒rAAV-hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带有金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞；
所述人金属硫蛋白基因经EcoR I和Xho I双酶切后插入pAAV-MCS,构成重组腺相关病毒载体pAAV-MCS-hMT；
所述步骤(4)重组腺相关病毒rAAV-hMT感染脐带间充质干细胞的步骤为：将重组腺相关病毒rAAV-hMT按20MOI加入第2代对数生长期脐带间充质干细胞培养液中，5％CO2，37℃细胞培养箱培养24小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)获得重组腺相关病毒株rAAV-hMT的步骤为：收集细胞悬液轮流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰冻和37℃水浴箱中融化，反复冻融4次，每次10分钟，室温下10000g转速离心10分钟，收集上清液，纯化并测定毒株滴度。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法得到的携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞在制备治疗衰老或由氧自由基、重金属Cd2+和铅导致的疾病的制品中的应用。
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