[发明专利]一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞及其应用

说明书

本发明涉及一种携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞的制备方法，其包括如下步骤：构建携带金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒载体质粒pAAV‑MCS‑hMT；制备携带人金属硫蛋白基因的重组腺相关病毒rAAV‑hMT，测定滴度；将重组腺相关病毒rAAV‑hMT感染脐带间充质干细胞，得到携带人金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞。本发明得到的携带金属硫蛋白基因脐带间充质干细胞用于衰老模型小鼠，能有效延缓小鼠衰老进程；将其用于高血铅模型小鼠，可明显降低小鼠血铅含量。

技术领域

本发明属于干细胞再生医学技术领域。更具体地，本发明涉及一种携带人金属硫蛋白（Human Metallothionein，hMT）基因的脐带间充质干细胞的制备方法，及其在氧自由基、重金属导致疾病或衰老治疗中的应用。

背景技术

金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是指一类低分子量、高巯基含量（20%-30%），能大量结合金属离子的性能独特的蛋白质或活性肽。在人体、动物、植物以及微生物体内均广泛存在。MT具有非常保守的一级结构和相似的空间结构，在许多物种中MT以多种亚型存在。

MT具有较强的清除自由基的作用。自由基过剩或任何引起自由基过程剩的因素均会引起细胞病变，影响细胞正常功能的发挥，甚者引起衰老及疾病。天然形式下MT中的巯基均以还原状态存在，巯基具亲核性，从而使MT易与亲电性物质特别是某些自由基相互作用。MT对自由基如羟自由基(OH) ，氧自由基(O₂)或一氧化氮(NO)等有较强的清除作用。MT是讫今为止发现的清除自由基最强的活性蛋白蛋（或多肽），其清除羟自由基（OH）的能力约为SOD的10,000倍，而清除氧自由基（O）的能力约是谷胱甘肽（GSH）的25倍。

MT富含巯基及其重金属结合能力决定了它在重金属解毒方面起着重要的作用。MT的巯基基团（-SH）能强烈螯合有毒重金属Hg、Pb、Cd、As等，其中螯合Pb的强度比Zn大200倍，而螯合Cd的强度又比Pb大10倍^[13]，从而使它们无法毒害人体，同时对体内Zn等微量元素无影响。这对保护大脑、肝、肾等人体重要器官具有极其重要意义。

目前，MT的来源主要有三类，一类是在培养基中添加金属离子，直接诱导微生物生产MT；另一类是对动物喂养含金属离子的饲料或者注射相关溶液，然后从动物内脏中提取MT；还有的就是利用基因工程技术生产MT。这几类生产方法都存在着产量极低，成本高、提纯步骤复杂的缺陷，更值得一提的是直接诱导法、动物提取法产生的MT为非人源性MT，且常结合有重金属，失去了清除氧自由基和结合重金属的能力。因此，针对MT的转基因治疗将逐渐成为研究的热点方向。

脐带间充质干细胞（umbilical-derived mesenchymal stem cells，UMSCs）是存在于脐带华通氏胶和血管周围组织中的一种干细胞，具有多向分化和自我更新的潜能。UMSCs具有以下优点：脐带是分娩后的废弃物，取材方便；UMSCs可在体外分离、培养，扩增迅速，且生物学特性稳定；UMSCs免疫原性低，异体移植不引起免疫排斥反应；UMSCs具有分泌SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、SDF-1、VEGF等因子的特性，具有免疫调节功能，可用于自身免疫性疾病、神经系统疾病的治疗。当前，针对MSC抗衰老、MSC基因修饰等研究才刚刚兴起，国内外尚无携带hMT基因UMSCs构建的报道，亦无其用于氧自由基、重金属导致的疾病治疗、抗衰老的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较强实用价值的携带人金属硫蛋白（HumanMetallothionein，hMT）基因的脐带间充质干细胞方法。得到的携带hMT基因的脐带间充质干细胞具有分泌hMT 、SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6等因子，去除氧自由基或重金属，调节体内微环境的特性。将其用于衰老模型小鼠，能有效延缓小鼠衰老进程；将其用于高血铅小鼠，可明显降低血铅含量。

本发明的携带人金属硫蛋白基因的脐带间充质干细胞制备方法，包含如下步骤：