[发明专利]一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种提取方法，具体是一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法。

背景技术

高质量的RNA和DNA在植物分子生物学研究中具有重要的作用，关系到后续分子生物学研究的成功与否，如分子标记、基因克隆、基因上游启动子序列的分离、Southern印迹分析、表达特性分析和cDNA文库构建等。另外，随着分子生物学的发展，实验中对所需的核酸要求不但质量高，而且类型多样，可能有的实验需要总核酸、部分实验需要总RNA、还有实验需要基因组DNA。

目前，关于植物总核酸、总RNA和基因组DNA提取方法的报道较多，技术也非常成熟，但多是在植物中应用不同方法分别对总核酸、总RNA和基因组DNA进行提取，在应用中，由于分子生物学研究需要的核酸类型多样，如分别提取总核酸、总RNA和基因组DNA，过程较为繁琐。经检索，对于采用一种方法或一套试剂从植物中同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA的方法，未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，可以同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA，不仅节约了时间，而且节约了提取成本，以满足多种分子生物学研究的需要。

本发明所采用的技术原理：

总核酸的提取：提取总核酸时，用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂进行抽提。理论上，当用水饱和酚（pH ≈ 5，呈酸性）进行抽提时，RNA溶解于酸性的水相，DNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离。但实验表明，水饱和酚只能去除少量的DNA，所以本方法采用水饱和酚提取总核酸。提取总核酸时所用氯仿的作用主要有以下几点：1、它是分子量比较大的有机溶剂，能加速有机相与水相分层；2、它能去除核酸溶液中的痕量酚（酚易溶于氯仿中）；3、它能使蛋白质变性；4、它作为有机溶剂可抽提样品中的一些脂溶性杂质（如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。 

总RNA的提取：提取总RNA时，除了用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂进行抽提，还用到高浓度的酸性醋酸钾溶液，该溶液能使多糖和DNA一起沉淀下来，使得水相中就只剩下RNA。

基因组DNA的提取：提取基因组DNA时，用Tris-饱和酚（pH > 7.8）和氯仿组成的混合试剂进行抽提。Tris-饱和酚的中性偏碱性的环境使DNA处于水相，RNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离，但实验证明，Tris-饱和酚也只能去除少量的RNA。为了有效去除RNA和多糖，本方法中加入无水乙醇，原因在于这个体积比的无水乙醇能将多糖和RNA一起沉淀下来，使得水相中就只剩下DNA。氯仿的作用与总核酸的提取中的描述相同。

本发明所采用的技术方案：

一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，其步骤如下：

1、粗提

将植物材料粉碎后与SDS提取液混合，60～70℃水浴10～60分钟；离心，取上清得到粗提物上清液，三等分粗提物上清液后分别用于总核酸、总RNA和基因组DNA的提取。

所述植物材料是指富含多糖多酚的植物，进一步优选香蕉。

所述植物材料粉碎是在液氮中将植物材料研磨成粉末。

所述的离心条件为：转速8000～12000 rpm，时间5～20分钟。

2、提取

总核酸的提取：在粗提物上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到包含总RNA和基因组DNA的总核酸。所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。

总RNA的提取： 在粗提物上清液中加入1／5～5／5体积的醋酸钾溶液，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相，得到第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到总RNA。所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。