[发明专利]建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域。具体的，本发明涉及分离干细胞的方法及其用途。更具体的，本发明涉及分离干细胞的方法，利用该方法所得到的干细胞或其衍生物，以及该干细胞或其衍生物在制备药物中的用途。

背景技术

间充质干细胞（MSC）最近受到了广泛关注，因为其具有有利于移植的性质，即其具有多潜能和非免疫原性。已经报道了可以从成人骨髓和胎儿组织分离获得间充质干细胞（MSC）。从骨髓分离的MSC（BM MSC）已经被报道为在体外具有高增殖潜能的多潜能细胞。BM MSC能够分化为脂肪细胞(A)、成骨细胞(O)、软骨细胞(C)以及血管平滑肌(V)谱系，但不能分化成骨骼肌细胞、心肌细胞、造血细胞、肝细胞或神经细胞谱系。这暗示了他们可以用于众多受损组织的细胞治疗：骨骼、软骨、中枢神经细胞和心肌组织。

首先，从间充质干细胞的体外分离方法上来看，主要有贴壁法，密度梯度离心法，流式细胞术和免疫磁珠分离法。前两种方法的缺点主要在于细胞纯度较低；后两种方法的共同缺点在于1）没有真正特异性的细胞表面标记；2）对细胞活性有较大影响，易造成MSCs的损伤，出现增殖缓慢等问题；3）操作复杂，价格昂贵，一般仅限于实验室应用。这些存在的技术瓶颈问题在很大程度上限制了MSCs的临床应用与发展。然而，目前还没有能够分离单克隆间充质干细胞的方法。其次，从间充质干细胞临床运用角度来看，目前主要开展的自体干细胞移植技术在临床各类疾病中得到广泛运用。但缺点在于：骨髓来源取材不便，易造成自体损伤；外周血来源必须借助外源性刺激，使干细胞达到一定数量；脂肪来源虽避免了上述劣势，但存在体外扩增的致瘤性及血清使用的致病性。

因此，建立单克隆间充质干细胞的方法有待于进一步地改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效分离干细胞的方法，利用该方法能够获得单个细胞形式的干细胞，进而可以获得由单个细胞形成的干细胞单克隆集群。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：A）利用胶原酶对动物样本进行消化，以便分散所述动物样本中所包含的细胞，以便获得包含干细胞的细胞混合物；B）将编码报告蛋白的核酸分子引入所述细胞混合物的至少一部分细胞中，其中，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连，以便在间充质干细胞中表达所述报告蛋白；以及C）利用FACS，分选获得表达所述报告蛋白的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞呈单个细胞的形式。根据本发明实施例的方法，由于编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连，因此，该编码报告蛋白的核酸分子将会在细胞混合物中所包含的间充质干细胞中得到特异性表达，从而利用细胞流式分选手段，可以对特异性表达报告蛋白的间充质细胞进行有效分选，从而得到单个细胞形式的间充质干细胞。

根据本发明的实施例，前述方法还可以具有下列附加技术特征：

在本发明的一个实施例中，所述动物样本为来自选自肝脏组织、脂肪组织、骨实质、肌肉、脐带血、脐带、胎盘、外周血、胰腺、肺脏、经血和牙髓的至少一种。可选的，所述动物样本为来自胎儿肝脏组织及成人骨髓组织。从而可以有效地提高分离间充质干细胞的效率。

在本发明的一个实施例中，将编码报告蛋白的核酸引入所述细胞混合物的至少一部分细胞中包括：利用液体培养基对所述细胞混合物进行培养；将构建体引入所述培养获得的贴壁细胞中，其中，所述构建体包括：编码报告蛋白的核酸分子；以及间充质干细胞特异性启动子，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连。由此，可以有效地将编码报告蛋白的核酸分子引入到细胞中，并且可以使得编码报告蛋白的核酸分子能够有效地在间充质干细胞中获得表达。

在本发明的一个实施例中，所述液体培养基为α-MEM培养基。由此，可以进一步提高后续分离间充质干细胞的效率。根据本发明的实施例，该培养基还可以添加EGF或FGF2等生物因子，从而维持MSC的最佳生物学特性及分化潜能。