[发明专利]一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及邻苯二酚糖苷衍生物的制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶突变酶合成邻苯二酚半乳糖苷的方法，属于糖工程技术领域。

技术背景

酚类化合物是一类带有芳香环结构的化合物，具有多种生理学和药理学功能，如儿茶酚具有抗氧化作用、Avarol能抑制HIV的复制等。酚类化合物的糖基化不仅可以增加水溶性，还能改进药理学性质和疗效。例如：对苯二酚具有毒性，而对苯二酚-α-葡萄糖苷(熊果苷)则具有抗菌和皮肤增白效果；子丁香酚由于抑制5α-还原酶而具有修护头发的功能，但其易升华，有特殊气味，化学法糖基化形成的子丁香酚-β-葡萄糖苷能被头皮上存在的微生物缓慢代谢，逐渐降解释放酚类结构，有利于药效的发挥。可以说，新的酚类化合物糖苷具有新的药理学性质，不同糖基化修饰的酚类化合物性质不同，例如对苯二酚半乳糖苷抗氧化活性比熊果苷增高了1.19倍。

邻苯二酚是一种精细化学品的基本原料，广泛用于农药、香料、医药、染料、聚合物等行业，市场潜力巨大。目前邻苯二酚衍生物的开发多采用化学法，酶法衍生化仅有一例相关报道，采用α-葡萄糖苷酶对带有邻苯二酚结构的儿茶酚化合物进行葡萄糖基修饰，尚无邻苯二酚的酶法半乳糖基修饰报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法。

一种邻苯二酚半乳糖苷的制备方法，包括如下步骤：

（1）采用磷酸缓冲液配制乳糖浓度为0.1M～0.3M，邻苯二酚浓度为0.05M～0.2M，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶添加量为2μg～10μg/mL的反应体系；

（2）将步骤（1）制得反应体系于37～45℃水浴中反应20～60分钟，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；

（3）将步骤（2）制得的上清液，经分离、干燥后，制得邻苯二酚半乳糖苷。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-半乳糖苷酶选用GenBank登录号为ACE06986.1，将第980位色氨基酸用苯丙氨酸取代，制得。取代后的β-半乳糖苷酶可按照发表文献[Synthesis of galactosyl sucralose byβ-galactosidase fromLactobacillus bulgaricus L3,Food Chem,2012,134:269-275]所述方法制备酶蛋白。上述β-半乳糖苷酶对邻苯二酚具有显著转糖基活性。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应45分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸5分钟。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的分离采用制备型薄层层析板分离，型号Silica gel60F254(Merck,Germany)。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的干燥为冷冻干燥。

根据本发明进一步优选的，所述步骤（3）中还包括分离时的薄层层析检测，合并迁移距离相同的产物的步骤。

上述薄层层析检测的步骤如下：

薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。

上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是体积百分比为20%的硫酸和浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。

有益效果

本发明以邻苯二酚为原料，以廉价乳糖底物为半乳糖基供体，采用经过突变的β-半乳糖苷酶合成邻苯二酚半乳糖苷，产物与其原料邻苯二酚相比，含有半乳糖基，增加了水溶性和稳定性。该化合物自身可作为一种化学合成中间体，用以衍生合成新的高附加值化合物，在化工、医药等各方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为邻苯二酚半乳糖苷的质谱图；

图2为邻苯二酚半乳糖苷的氢谱；

图3为邻苯二酚半乳糖苷的氢氢相关核磁图谱；

图4为邻苯二酚半乳糖苷的碳氢直接相关核磁图谱；

图5为邻苯二酚半乳糖苷的碳氢远程相关核磁图谱。