[发明专利]蛋白质的聚乙二醇化修饰方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质修饰领域，具体地说，涉及蛋白质的聚乙二醇化修饰方法。

背景技术

随着基因工程技术的发展，蛋白质、多肽类药物的临床应用越来越受到重视。然而蛋白质、多肽类药物普遍存在诸如稳定性差、体内半衰期短以及存在免疫原性等缺陷严重制约了其应用和发展。聚乙二醇（PEG）能够使蛋白药物溶解行为改善、稳定性增强、免疫原性消除或降低、体内循环半衰期延长、药代动力学优化，因此在生物技术和生物制药开发中具有重要的应用价值和广泛的应用前景。目前，PEG已应用于多种蛋白药物的修饰，如PEG修饰的门冬酰胺酶、干扰素等多种蛋白质药物已陆续通过美国食品和药物管理局（FDA）批准应用于临床。

然而，在PEG修饰过程中，非特异性修饰和多位点修饰会带来蛋白类药物均一性差，活性减弱和纯化困难等问题，构成了目前以液相条件为基础的PEG修饰的发展和应用局限。尽管对修饰条件进行优化，实际修饰反应过程中还是有许多副产物产生。此外，液相条件下的烷基化PEG修饰产物经常需要进行多步纯化步骤才能去除杂质，如还原剂、未反应的PEG以及多位点修饰产物等。因此，亟待开发一种特异性更强且具备可控性的单一位点PEG修饰方法，进而在改善药用蛋白生物功能的同时简化相应修饰蛋白的制备工艺。

随着对PEG修饰研究的深入，近年来逐步发展起来的固相修饰技术已经显示出与液相修饰相比较为突出的优势，主要集中表现为修饰效率更高，修饰特异性更强，纯化制备工艺简单，且通过固相修饰获得的蛋白保留了更好的生物学活性，这为药物蛋白的PEG修饰提供了新思路。固相PEG修饰过程一般是先将蛋白吸附到固体基质上，然后以PEG修饰制剂作为流动相在色谱柱上循环流过，对吸附于柱上的蛋白实现PEG修饰，待修饰反应结束后，PEG化的蛋白可以采用盐溶液洗脱获得修饰混合物或者直接从未修饰蛋白及其他修饰副产物中分离纯化获得目的修饰产物。理论上讲，固相修饰方法可以降低分子间的碰撞和蛋白表面基团的自由度，从而降低PEG修饰反应过程中副产物的产生，减少后续纯化步骤。目前已知的固相修饰工艺主要集中于以离子交换层析色谱和亲和层析色谱为固相吸附材料（反应载体）。但通过大量前期研究发现，现有的离子交换或者亲和色谱固相修饰并不能适用于所有的功能蛋白，就离子交换层析色谱固相修饰技术而言，其可能的原因是由于吸附蛋白与离子固相之间的静电相互作用遮蔽了PEG修饰的位点而导致PEG修饰反应不能进行；而亲和层析色谱则要求目的蛋白能够与层析色谱柱产生特异性结合，这对蛋白与亲和色谱柱的结合力提出了较高的要求，使应用范围大大受限。

发明内容

本发明旨在弥补现有液相和固相PEG修饰工艺的不足，提供一种以疏水层析色谱柱为反应载体的新型蛋白固相聚乙二醇修饰工艺。

为了实现本发明目的，本发明的一种蛋白质的聚乙二醇化修饰方法，其是以疏水层析色谱柱为固相反应载体的蛋白质的聚乙二醇化修饰方法。

对于疏水性强的蛋白（如溶菌酶、α-糜蛋白酶等），在高盐状态下将蛋白吸附于疏水层析色谱柱上，以聚乙二醇修饰剂为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱（或低盐缓冲液洗脱）获得聚乙二醇修饰的蛋白。

对于疏水性弱的蛋白（如重组酸性成纤维细胞生长因子rhaFGF、重组碱性成纤维细胞生长因子rhbFGF等），在高盐状态下将聚乙二醇修饰剂吸附于疏水层析色谱柱上，以蛋白溶液为流动相，反应完成后采用盐离子梯度洗脱（或低盐缓冲液洗脱）获得聚乙二醇修饰的蛋白。

前述方法中，所述疏水层析色谱柱的填充物质包括HiTrap Butyl FF、HiTrap Octyl FF或HiTrap Phenyl FF等。本发明中采用的疏水层析色谱柱为可以市售获得的预装疏水柱（HiTrap Butyl FF、HiTrap Octyl FF和HiTrap Phenyl FF），柱体积均为1mL。

前述方法中，所述聚乙二醇修饰剂包括聚乙二醇-丁醛、聚乙二醇-丙醛或聚乙二醇琥珀酸酯等，其分子量大小为5kDa-40kDa，优选20kDa。

前述方法中，所述高盐状态是指将蛋白或聚乙二醇修饰剂溶解于含有2-3M氯化钠的磷酸盐缓冲液（如20mM pH6.0的PB缓冲液）中。

采用上述方法制备获得单一较好且活性保持率高的PEG修饰蛋白，所得PEG修饰蛋白单一修饰率达到40%以上，活性保持率达到80%以上，为实现蛋白的PEG修饰提供新工艺。

附图说明

图1为本发明实施例1中基于疏水层析色谱柱的溶菌酶固相PEG修饰产物的洗脱图谱。