[发明专利]一种艾塞那肽高效分离纯化方法

权利要求书

1.一种艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于，采用二维正交液相色谱分离纯化体系对艾塞那肽粗品进行分离纯化，采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即二维正交体系分别采用反相/阴离子交换RP/SAX混合模式填料和反相/阳离子交换RP/SCX混合模式填料为固定相；

所述RP/SAX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SAX为一种季铵基基团，RP/SAX的结构式为式Ⅰ：

其中，R₁为C₂～C₆的烷基中的一种，R₂为C₁～C₈的烷基中的一种；

所述RP/SCX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SCX为一种磺酸基基团，RP/SCX的结构式为式Ⅱ：

其中R₃为C₁～C₆烷基中间的一种，R₄为C₁～C₈烷基或苯基的一种。

2.按照权利要求1所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：在RP/SAX混合模式色谱中，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100～100:1在RP/SCX混合模式色谱中，直链正烷基键合基团与磺酸基键合基团的比例为1:100～100:1。

3.按照权利要求1或2所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：所述二维正交分离纯化体系中，第一维使用反相/阴离子交换分离纯化体系，即RP/SAX；第二维使用反相/阳离子交换分离纯化体系，即RP/SCX。

4.按照权利要求3所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：第一维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。

5.按照权利要求4所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于，在第一维分离纯化体系中：

A相缓冲盐选自a、b或c，其中：

a、磷酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 5.0-8.0；

b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 5.0-8.0；

c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 5.0-8.0；

C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；

D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5％～80％。

6.按照权利要求3所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：第二维分离纯化体系流动相为，A相：缓冲盐，B相：水，C相：高氯酸钠，D相：乙腈。

7.按照权利要求6所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于：在第二维分离纯化体系中：

A相缓冲盐选自a、b或c，其中：

a、磷酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 2.0-5.0；

b、甲酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 2.0-5.0；

c、乙酸三乙胺缓冲盐，浓度50-200mM，pH 2.0-5.0；

C相高氯酸钠水溶液的浓度为100-1000mM；

D相乙腈含量变化特征在于：0-240min，5％～80％。

8.按照权利要求1～2、4～7任一所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法其色谱操作参数如下：

进样量：100μL-1000mL；

流速：0.5-300.0mL/min；

柱温：15-60℃；

色谱柱内径：4.6-100mm；

色谱柱柱长：250-1000mm。

9.按照权利要求1～2、4～7任一所述艾塞那肽液相色谱分离纯化方法，其特征在于具体步骤如下：

1)、称取适量艾塞那肽粗品，用Tris盐-甲醇溶解，配制成浓度为100mg/mL的溶液，用0.22m滤膜过滤，待用；

2)、一维使用阴离子交换-反相分离：色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0mL/min，柱温15-60℃，进样量1μL～1000mL；流动相中添加50-200mM的缓冲盐和浓度为100-1000mM的高氯酸纳，乙腈为强洗脱溶剂，等度或梯度条件洗脱，按峰形收集馏分，馏分使用低温离心浓缩冻干；

3)、二维使用阳离子交换-反相混合模式色谱柱分离；色谱柱内径4.6-100mm，色谱柱柱长：250-1000mm，流速0.5-300.0mL/min，柱温15-60℃，进样量1μL～1000mL；流动相中添加50-200mM的缓冲盐、浓度为100-1000mM的高氯酸纳，乙腈为强洗脱溶剂，梯度条件洗脱，按峰形收集馏分，馏分使用低温离心浓缩冻干。