[发明专利]一种艾塞那肽高效分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于化学合成多肽的分离与纯化技术领域，具体涉及一种艾塞那肽纯化分离方法。

背景技术

多肽是由20种氨基酸以不同的组成和排列方式通过肽键（酰胺键）相互连接而成的化合物，除了是组成蛋白质的基本结构单元，同时也是生物体内的重要活性物质，在生物界中分布较为广泛。在生命活动当中，涉及到各种毒素、激素。抗菌肽、信息素、细胞因子等的生物活性多肽广泛参与分子识别信号传导、酶活调节、免疫调节以及细胞分化等过程；生物活性多肽的开发和利用越来越受到科学家的重视，在医药、食品、化妆品等行业中的应用日益广泛，尤其是医药行业当中，已经有大量的生物活性多肽通过了临床试验并投放市场，如降血糖的艾塞那肽、治疗乙型肝炎的胸腺肽、咖啡肽等等；

研究表明，艾塞那肽是一种由39个氨基酸组成的多肽，其结构与人的胰高血糖素（Glucagou）有48%的同源性，与人的GLP-1（胰高血糖素样肽-1）有53%的同源性。艾塞那肽是胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，是促胰岛素分泌肽（Exendin-4）的化学合成类多肽，是一种新型的治疗糖尿病的药物；艾塞那肽不仅能够起到降低血糖的作用，同时不但不引起患者体重的增加反而可以降低其体重，因此，在今后的一段时间内，艾塞那肽在糖尿病的治疗当中将会占据着举足轻重的地位。

多肽样品组成比较复杂，含量低，不同组分之间丰度差异比较大，由于液相色谱峰容量的限制，基于单维的色谱分离方法和技术已经不能满足多肽分离的需要；近年来，二维甚至多维高效液相色谱已经成为多肽分离纯化的发展主流，经过20多年的研究，学者们已经构建了多种二维或者多维高效液相色谱系统用于多肽的分离纯化及制备；主要有离子交换-反相液相色谱（IEX-RPLC）、体积排阻-反相液相色谱（SEC-RPLC）、以及亲水-反相液相色谱（HILIC-RPLC）等等；这些二维模式多肽的分离分析及纯化制备过程当中显示了极大的分离能力。

在离子交换-反相的二维分离体系当中，离子交换色谱依据样品所带电荷的不同而导致与固定相的作用力不同从而实现分离，而反相色谱依据疏水作用力实现对样品的分离，由于两者的作用机理相互独立，因此具有良好的正交性；这种二维的分离模式也是目前多肽纯化中使用较为广泛的分离技术；体积排阻色谱依据被分离组分的分子大小而实现分离，亲水色谱根据亲水性的不同实现对不同组分的分离，这二者与反相色谱也有一定的正交性，适合于多肽的分离纯化；目前还没有报道将二维正交的反相/阴离子交换混合模式色谱（RP/SAX）和反相/阳离子交换（RP/SCX）混合模式分离纯化方法应用于艾塞那肽的纯化分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高选择性的艾塞那肽纯化分离方法，该方法采用二维的分离纯化方法：采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即反相/阴离子交换（RP/SAX）混合模式和反相/阳离子交换（RP/SCX）混合模式，并通过对缓冲盐种类、浓度、pH条件的优化以及流动相梯度条件的优化，使样品具有适当的保留，并且可以达到良好分离。

本发明提供的艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于，采用二维正交分离纯化体系对艾塞那肽粗品进行分离纯化，采用极性共聚的方法将具有特异性的静电作用引入到没有特异性的单纯依靠疏水作用的反相色谱中，即RP/SAX混合模式和RP/SCX混合模式。

本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：所述RP/SAX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SAX为一种季铵基基团，RP/SAX的结构式为式Ⅰ：

其中，R₁为C₂～C₆的烷基中的一种，R₂为C₁～C₈的烷基中的一种；

所述RP/SCX混合模式色谱中，RP为直链正烷基结构，SCX为一种磺酸基基团，RP/SCX的结构式为式Ⅱ：

其中R₃为C₁～C₆烷基中间的一种，R₄为C₁～C₈烷基或苯基的一种。

本发明所述艾塞那肽高效分离纯化方法，其特征在于：在RP/SAX混合模式色谱中，直链正烷基结构与季铵基比例为1:100～100:1在RP/SCX混合模式色谱中，直链正烷基键合基团与磺酸基键合基团的比例为1:100～100:1。