[发明专利]一种与临床原因不明的NOA相关的线粒体DNA SNP标志物及其应用

说明书

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与临床原因不明的NOA（非梗阻性无精子症）相关的线粒体DNA SNP标志物及其应用。 

背景技术

全世界约有8－15%的育龄夫妇具有不同程度的生育障碍，其中男方因素约占50%。研究表明，半个多世纪以来，人类精液质量显著下降，目前认为精子生成障碍的发生是一个多因素、多阶段的过程，是环境危险因素（外因）和个体遗传因素（内因）共同作用的结果。其中，个体遗传因素包括染色体遗传因子改变、表观遗传修饰异常及线粒体基因组遗传结构变异。线粒体基因组作为核外唯一的基因组，其遗传结构变异被认为是男性不育最重要的遗传病因之一。 

线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）存在于线粒体胞浆中，较核基因组DNA具有相当程度的独立性。人类mtDNA是16569bp（GenBank登录号NC_012920）的闭环核外基因，包括富含鸟嘌呤的重（H）链和富含胞嘧啶的轻（L）链，有37个基因负责编码细胞中13个蛋白质亚基，22种转运RNA（tRNA）和两种核糖体RNA（rRNA），12S和16S的tRNA基因为线粒体蛋白质的合成所需，这13个蛋白质亚基都是呼吸链酶复合物的亚单位，包括复合物I（NADH-Q还原酶）、复合物Ⅱ7亚基（ND1到ND6以及4L）、复合物III（细胞色素b）、细胞色素氧化酶3亚基（COXI、COX II和COX III）、复合物IV和复合物V（ATP酶6和8亚基），与细胞核DNA编码复合物Ⅱ一起参与氧化磷酸化。与核基因不同，线粒体DNA无内含子，所有编码序列是连续重叠的，mtDNA中任何突变都会累及基因组中的重要功能区域。此外，线粒体缺少组蛋白或DNA捆绑蛋白保护，且复制快速，无有效的校正读码和DNA修复机制，因此其突变率高于核DNA的10-100倍。哺乳动物精子细胞尾部中段含有约72-80个线粒体，线粒体是精子中唯一的细胞器，为精子生成提供ATP，精子线粒体在精子生成方面起到了十分重要的作用。 

目前，非梗阻性无精子症（NOA）的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、 精液参数、精浆生化、血性激素检测、B超以及染色体检测等。世界卫生组织在男性不育的诊断检查及处理手册指明：无精子症是指精子密度等于0，即使将精液离心后检查亦不能发现精子。临床上通常3次离心镜检精液仍未见到精子，同时，排除不射精和逆行射精后方可确诊为无精子症病人。常规的精子密度分析目前主要依靠精子密度判别（人工计数或利用计算机辅助系统分析，即CASA），尚无其他有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，如个体精液质量波动较大，尤其易受到禁欲天数、温度、采集精液方法等因素的影响，从而造成精子密度测量不准确；对相应疾病的早期诊断效果也远不能满足需要。而明确诊断常需进行睾丸穿刺活检，这给寻求生育帮助的人群带来极大的痛苦。尽管目前国内外研究者正努力探索新的NOA诊断生物标志物，并对现有评估手段进行有效的补充，但一直难以突破传统生物标志物发展和男性生殖实际应用中的瓶颈，即有创穿刺活检、精液质量分析结果波动、以及早期诊断困难等。此外，由于病因不明，缺乏有效的治疗手段，大多数NOA病人只能选择ICSI或AID等辅助生育手段，不仅无法满足心理上的要求，而且有可能出现后代的遗传缺陷。 

研究表明，遗传因素是引起男性不育的主要因素，线粒体遗传变异在其中起重要作用。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。遗传变异的存在被认为赋予了个体不同的表型性状，以及对于环境暴露、药物治疗等因素的不同反应性，因此遗传变异可能是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。利用疾病易感的遗传变异谱对相关疾病进行辅助诊断，不仅灵敏、准确和快速，具有广阔的应用前景。目前还没有将线粒体DNA遗传变异应用于NOA诊断的报道，若能筛选出NOA易感的线粒体DNA遗传变异作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对NOA的诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。 

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与临床原因不明的NOA相关的线粒体DNA SNP标志物。 

本发明的第二个目的是提供上述SNP标志物的特异性引物。 

本发明的第三个目的是提供上述SNP标志物的特异性荧光探针对。 

本发明的第四个目的是提供上述SNP标志物及其特异性引物和/或特异性荧光探针在制备临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒中的应用。 

本发明第五个目的是提供临床原因不明的NOA辅助诊断试剂盒。