[发明专利]南方松树丛芽诱导及继代培养方法

权利要求书

1.一种南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：包括外植体选择与处理、丛生芽诱导、丛生芽伸长、继代芽培养，获得规模化组织培养南方松树继代芽，其操作步骤如下：

（1）外植体选择与处理：将松树种子消毒后，在无菌条件下进行种子萌发，然后截取带0.5 cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体进行组织培养；

（2）丛生芽诱导：将无菌外植体接种在诱导培养基中进行丛芽诱导，培养周期：20-26 d，培养温度：24±1℃，光照培养时间：0-16 h，光照强度：0-2000 lx，获得丛生芽；

（3）丛生芽伸长：将诱导出的丛生芽在伸长培养基中进行伸长培养，培养周期：14-28 d，培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，获得丛生伸长芽；

（4）继代芽培养：将单个切下伸长芽的顶芽接种到继代增殖培养基中进行增殖，培养周期：14-21 d，培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，获得继代芽Ⅰ；将继代芽Ⅰ重复步骤（3）进行伸长，单个切下伸长的继代芽Ⅰ并分成顶芽和带侧芽芽段，然后在步骤（4）继代增殖培养基中继续增殖获得继代芽Ⅱ，将继代芽Ⅱ再重复步骤（3）和步骤（4），获得新的增殖继代芽；重复循环步骤（3）和（4），从而实现规模化增殖继代组培南方松树继代芽。

2.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的继代芽Ⅰ是选用单个切下无水渍样、无玻璃化现象、生长活力旺盛的丛生伸长芽的2 cm长顶芽进行增殖而得。

3.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的继代芽Ⅱ是选用继代增殖芽继代芽Ⅰ进行伸长至3-5 cm，并分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段进行继代增殖而得。

4.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的继代芽培养是重复循环继代芽增殖、丛生芽伸长过程，进行N次培养。

5.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的诱导培养基为改良MS培养基+6-BA 2.5-4.0 mg·L^-1+NAA 0.05-0.1 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1+水解酪蛋白500 mg·L^-1，pH值为5.6-6.0。

6.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的伸长培养基为：改良MS培养基+NAA 0.25-0.4 mg·L^-1或活性炭3000-5000 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1，pH值为5.6-6.0。

7.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的继代增殖培养基为：改良MS培养基+6-BA 1.0-3.0 mg·L^-1+KT 0-1.0 mg·L^-1+NAA 0-0.3 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1，pH值为5.6-6.0。

8.根据权利要求1所述的南方松树丛芽诱导及继代培养方法，其特征在于：所述的改良MS培养基的基本组成为：KNO₃ 1650 mg·L^-1；NH₄NO₃ 600 mg·L^-1；CaCl₂·2H₂O 260 mg·L^-1；MgSO₄·7H₂O 370 mg·L^-1；Ca(NO₃)₂·4H₂O 400 mg·L^-1；KH₂PO₄ 170 mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 22.3 mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.025 mg·L^-1；H₃BO₃  6.2 mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 mg·L^-1；KI 0.83 mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O 0.025 mg·L^-1；维生素B₁ 1.0 mg·L^-1；维生素B₆ 0.5 mg·L^-1；烟酸 0.5 mg·L^-1；甘氨酸 2.0 mg·L^-1；肌醇 200 mg·L^-1。