[发明专利]一种高灵敏度检测人肠道病毒的方法

权利要求书

1.一种可同时检测多种人肠道病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.75的多核苷酸。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述人肠道病毒包括：柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型（A、B亚型），柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型（A、B、C亚型）,埃可病毒1、4、7、19、25型。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.46为人肠道病毒的正向和反向引物序列；SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.73为碱基延伸探针序列；SEQ ID NO.47-SEQ ID NO.50为质控引物序列；SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75为探针序列。

4.权利要求1的试剂盒的使用方法，其特征在于，每种病毒采用针对VP1基因区序列探针检测，所述方法包括以下步骤:

(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区域中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该病毒特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；

（2）第一次PCR扩增反应，将dUTP/dATP/dGTP/dCTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；

（3）用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；

（4）第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs或类似核酸末端终止剂加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少20Da；

（5）采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；

（6）纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人肠道病毒的类型。