[发明专利]一种高灵敏度检测人肠道病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原微生物的检测方法，特别涉及一种高灵敏度检测与手足口病相关的人肠道病毒的方法。

背景技术

人肠道病毒(HEV)属于微小核糖核酸病毒科，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组和B组（CVA和CVB）、埃可病毒（E）、新型肠道病毒等，目前有100多个型。人肠道病毒可引起脊髓灰质炎、手足口病、疱疹性咽峡炎、急性出血性结膜炎等。

手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）是一种世界范围广泛流行的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。重症病例死亡率较高。我国于2008年将其纳入法定传染病进行管理。手足口病由肠道病毒引起，引发手足口病的肠道病毒主要包括柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型，柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型，埃可病毒1、4、7、19、25型等，其中以柯萨奇病毒A16型（CVA16）和肠道病毒71型（EV71）最为常见。肠道病毒71型感染往往伴随着严重的并发症，如无菌性脑膜炎，脑炎，急性弛缓性麻痹，甚至导致死亡。而柯萨奇病毒A16型引起的手足口病的症状往往较轻。同时，肠道病毒的多重感染也是其临床症状较重的一个因素。因此及时检测并鉴定引起手足口病的病原体，对临床治疗及患者预后的判断有极为重要的价值。

人肠道病毒的检测方法目前多采用特定类型的抗血清的中和试验或反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法。现有方法的局限性主要有几个方面：缺乏全面的同时检测多种人肠道病毒的方法；反转录聚合酶链反应方法依赖于测序且特异性不好；灵敏度较低易发生假阴性等。

发明内容

本发明提供了一种高灵敏度高通量可同时检测21种人肠道病毒基因型的方法。

本发明检测的21种人肠道病毒包括：柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型（A、B亚型），柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型（A、B、C亚型）,埃可病毒1、4、7、19、25型。检测部位为编码病毒衣壳蛋白的晚期编码区VP1区和HEV各基因型最保守的5’端非编码区序列5’UTR，设计HEV基因型特异引物和通用引物。

本发明的检测方法，包括以下步骤：

1、引物设计：涵盖2013年2月之前公开发表的21种人肠道病毒，包括：柯萨奇病毒A组(CVA)2、4、5、6、8、9、10、12、16型（A、B亚型），柯萨奇病毒B组3、4、5型，肠道病毒71型（A、B、C亚型）,埃可病毒1、4、7、19、25型。根据待测人肠道病毒全序列，获取VP1基因区，选择每种病毒的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基（ACGTTGGATG）任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种人肠道病毒的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种人肠道病毒扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。

2、PCR反应:在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶（UNG酶）技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。

3、虾碱性磷酸酶（SAP）处理：使未结合的剩余核酸（dNTPs）脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。

4、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，

5、树脂脱盐：纯化延伸反应产物。

6、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测人肠道病毒类型，软件自动处理报告每种病毒的检测结果和可信程度。

本发明的检测方法，优选的包括以下步骤：