[发明专利]卡介菌复合多糖及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种从卡介菌细胞壁中提取的卡介菌复合多糖的方法和提取的卡介菌复合多糖的用途。

背景技术

卡介菌多糖核酸是原湖南医科大学自20世纪70—90年代研发的新型生物反应调节剂。大量的研究显示，本品具有抗过敏、抗胞内感染、抗肿瘤等较强的免疫调节药理作用，临床用于防治感冒、哮喘等疗效好。其主要作用机制是：（1）诱导Th₀细胞分化成Th₁型细胞亚群，促进其分泌γ－干扰素（IFN－γ）、白介素－2（IL－2），刺激B细胞合成IgG2a，抑制合成IgG1，具有免疫调节和抗过敏作用；（2）增强单核－巨噬细胞功能，小鼠经腹腔注射本品，其腹腔巨噬细胞（MФ）数量增加，分泌酸性磷酸酶、溶菌酶增多，对胞内感染菌，如人型结核菌、白色念珠菌、仙台病毒等有杀灭作用；（3）增强自然杀伤细胞（NK）活性，促使外周血中的γ/δT细胞扩增10～20倍，具有填补早期NK细胞及共性吞噬细胞介导的非特异性抵抗力和晚期αβT细胞介导的特异性免疫应答间的“空隙”（gap）作用，调节趋化、活化病变中的αβT细胞，具有抗肿瘤、抗胞内感染作用；（4）促进细胞毒T淋巴细胞（CTL）的细胞毒作用，从另一个角度发挥抗肿瘤、抗胞内感染的作用。本发明的负责人之一（高洁生）曾主持卡介菌多糖核酸防治儿童哮喘的研究，获得良好的临床疗效。其论文评为国际优秀论文；其治疗方法纳入全国儿童哮喘诊断治疗方案[中华儿科杂志，1998，36（12）：747]；其研究成果于1997年获得湖南省科委科技进步二等奖[湘科奖学（97）第002号，项目编号：9713204]。目前，市面上已有湖南九芝堂斯奇康生物制药有限公司生产的“斯奇康”（卡介菌多糖核酸注射液），0.5mg/支，经肌肉注射给药，被批准用于治疗慢性支气管炎、感冒、哮喘。但是，该产品推荐的使用剂量和给药时间为每次0.5mg,隔日1次，与我们研发使用的1.0mg，每3日1次不同。另一方面，众多的研究表明，某些细菌、植物中药来源的多糖具有明显的免疫调节作用，如丸山疫苗，它是人型结核杆菌青山株的提取物，其主要成分为阿拉伯甘露聚糖， 1992年日本厚生省批准该药作为治疗后肿瘤患者的白血病减少的药物（药品名 Ancer-20）；还有黄芪多糖、香菇多糖等。由于当时的条件和时间限制，没有进一步对卡介菌多糖核酸各个组分做进一步研究。因此需要挖掘卡介菌细胞壁中的复合多糖对免疫调节的更大作用。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种卡介菌复合多糖及其制备方法和用，以解决上述背景技术中的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种卡介菌复合多糖的制备方法，包括以下步骤：

   （1）将含有卡介菌标准菌株的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩展培养至生长成乳白色至暗橙色菌膜；

   （2）复合多糖粗提：将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，用极性有机溶剂在2-6℃沉淀复合多糖，获得粗制复合多糖；

   （3）复合多糖精制：将上述粗制复合多糖经阴离子交换柱及超滤处理后，冷冻干燥获得精制复合多糖，即卡介菌复合多糖。

作为进一步的方案：步骤（1）具体包括以下步骤：

1）制备苏通液体培养基：将天门冬素 4.0g、MgSO₄.7H₂O  0.5g、枸橼酸 2.0g、枸橼酸铁胺 0.05g 、K₂HPO₄ 0.5g、丙三醇 6ml溶于800 ml蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml，以氨水调PH至7.2，再过滤后分装100 ml锥形瓶，102.9KPa高压灭菌20分钟，待冷后作无菌试验，置4℃冰箱保存；

2）菌种的扩大保存：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密至生长成乳白色至暗橙色菌膜，置4℃备用；

3）液体培养：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密后，离心去沉淀。

作为进一步的方案：卡介菌标准菌株的保存与鉴定：卡介菌丹麦株接种用罗氏鸡蛋斜面培养基上培养保存；增菌接种前，先经苏通培养基传代培养；传代培养后，对细菌生长情况进行检定，并经耐酸染色和革兰染色进行形态学鉴定；将鉴定合格的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养4周；由于本菌为表面生长，在苏通液体培养基表面生长成乳白至暗橙色菌膜。