[发明专利]一种斑马鱼类过敏检测模型的建立及其应用

说明书

本发明涉及一种斑马鱼类过敏检测模型的建立方法，同时提供一种利用该模型评价注射剂（包括辅料）致敏性方法。模型的构建方法主要包括：确定类胰蛋白酶（Tryptase）检测底物BAPNA的反应浓度，确定斑马鱼的发育阶段，确定检测用斑马鱼数量，确定阳性对照化合物Compoud48/80的浓度，微孔板分析,统计学分析几个步骤。应用活体斑马鱼模型进行注射剂（包括辅料）的致敏性评价具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，可实现体内高通量评价注射剂（包括辅料）的致敏性。本发明对注射剂（包括辅料）的安全性评价有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种体内检测模型，具体的说，涉及一种用于简单、快速和高效体内检测类过敏反应的斑马鱼模型构建方法及其应用。

背景技术

许多临床所使用的药物既不是抗原也不是半抗原，这些药物进入人体内，不经过潜伏期，无抗原与抗体的结合过程，迅速发生与Ⅰ型变态反应相同的临床表现。由于这种反应只发生于极少数接受治疗剂量药物的个体，没有致敏过程，患者血清IgE浓度也未见升高，但表现为典型的速发性变态反应症状，因此Dukor^[1]称之为假药物变态反应，或类过敏反应(anaphylactoid reactions)。

迄今为止，关于类过敏反应的认识很多是从临床病例中得到的，由于临床应用的新药不断增多、临床中用药复杂化、不适当的药物混合等原因，类过敏反应有增多趋势。最新调查研究表明77%的急性过敏反应为类过敏反应，类过敏反应发生率远高于Ⅰ型变态反应。目前，对类过敏反应在过敏反应中的定位仍未明确，但研究者们趋向于认为它和Ⅰ型变态反应为急性过敏反应的两个亚类^[2]。

动物实验和体外实验研究在阐明类过敏反应的发生机制、建立检测类过敏反应的试验方法用于注射剂的安全性评价上具有重要意义，但是由于类过敏反应发病快、病情急、病程转归迅速，迄今未见有成熟的动物模型，体外试验的检测指标和方法也有待于进一步优化。因此，建立一种高效、快速的体内类过敏检测模型具有重要意义。

斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低^[3]。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点^[3-4]：①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200～300枚卵；③生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有1-4 mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单：溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的疾病模型研究材料。

肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶（Tryptase）是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，经肥大细胞脱颗粒释放到细胞外，其在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性，可作为肥大细胞的激活和脱颗粒的标志。Tryptase通常只少量地分泌到体液中，当过敏引起肥大细胞脱颗粒时大量进入体液。类胰蛋白酶的急性过敏反应阳性反应和阴性反应的预测准确率分别为92.6%和54.3%，而且Tryptase的半衰期为2小时，因此，Tryptase的表达水平常作为类过敏反应的检测标志物之一^[5]。