[发明专利]一种用于检测氧化应激标志物d-ROMs的体外检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过检测血液中总的活性氧代谢产物(ROMs)含量从而评价人体内整体氧化应激水平。ROMs的主要成分为过氧化氢物(ROOH)，可作为体内氧化应激的标志物。该方法可用于测定氧化应激相关疾病：心血管疾病、神经变性疾病、代谢综合征、肿瘤等；暴露于危险因素的评价：吸烟、酗酒、不适当的运动、饮食不平衡；以及评估增加氧化水平的治疗：口服避孕药、放化疗、血液透析、干预旁路。

背景技术

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统的动态平衡失衡，从而导致DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常，最终引起组织损伤。

自由基具有不成对电子的原子或基团。自由基非常活泼，很容易与其他物质发生化学反应，生成活性氧代谢物(ROMs)。活性氧代谢物与氧自由基相比在血液中更稳定，因此可以在血液中被检测到，其评价氧化应激水平也更为准确。ROMs的主要成分为过氧化氢物(ROOH)，因此，d-ROMs检测主要是检测血液中的过氧化氢物，而不是直接检测人体的自由基数量。血液中d-ROMs的正常范围为250-300UNIT CARR(U CARR)；数值大于300U CARR表明机体处于氧化应激状态(1U CARR等于0.8mg/L H₂O₂)。

与全球体外诊断产品市场相对成熟不同，我国体外诊断市场仍处于发展的初级阶段。我国的诊断试剂市场规模仅为全球市场的1/14，人均消费量约为全球人均消费量的17％左右，即仍处于产品研发与生产的投入初期。因此，我国体外诊断市场的生存、发展和壮大依然是一个漫长的过程。随着生物技术的快速发展，我国体外诊断产业将面临更大的机遇和挑战。并且，我国人口众多，市场庞大，其中蕴含的经济利益和社会效益更是无法估量。研制价廉物美、操作简便的体外诊断方法和诊断试剂产品无疑是非常必要且具重要意义的。

目前国际上针对ROMs的氧化应激分析评估系统通常包括检测试剂、参考品(校准品、质控品)、分光光度仪整套系统，虽然在检测重复性、准确性上有很大优势，但相对操作过程复杂、经济花费较大。国内对于ROMs的检测，生产厂家几乎都没有生产相应质控品的经验和实力，因此市场上缺乏公众认可的检测ROMs的国产产品。本发明所涉及检测ROMs的方法为一步法，测定仪器为临床生化诊断最基本的和必备的检验设备自动生化分析仪，具有操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好等优点。针对ROMs的氧化应激分析可作为治疗方案制定或预后判断等的依据，因此具有相当重要的临床意义。

发明内容

针对现有氧化应激分析评估系统存在的问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、成功率高和稳定性好的检测ROMs的方法。

为实现上述目的，本发明涉及一种检测ROMs的方法，该方法包括：

1)全血离心，分离血清和血细胞；

2)取适量步骤1)中血清，加入Tris酸缓冲液配制的适宜浓度的芳香胺(DMPD，N，N-二甲基对苯二胺二盐酸盐)溶液；

3)血清中二价铁及三价铁在酸缓冲液中从血清蛋白中释放，过氧化氢物(ROOH)与二价铁及三价铁反应，生成烷氧自由基(RO^*)和过氧化自由基(ROO^*)；

4)步骤3)中生成的烷氧自由基(RO^*)和过氧化自由基(ROO^*)将芳香胺氧化，生成粉红色产物；

5)粉红色产物用波长为505nm的自动生化分析仪读数，颜色强度与读取OD值(ROMs浓度)呈比例；

6)在以上步骤进行的同时，步骤1)中血清以不同浓度的H₂O₂代替，余步骤不变，以不同浓度H₂O₂反应产物读取的OD值做标准曲线，由此计算出血清中过氧化氢物(ROOH)相当于H₂O₂的浓度。

其中，步骤3)和步骤4)中化学反应的原理图如下所示：

1A)R-OOH+Fe²⁺→R-O^*+Fe³⁺+OH^-