[发明专利]一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、提取DNA: 提取检测样本的基因组DNA，制得DNA样品；

B、DNA模板PCR反应：以DNA样品作为模板，采用能筛选出感染HPV病毒的DNA样品的引物进行PCR反应，扩增得到所述感染HPV病毒的DNA样品的PCR产物；

C、根据限制性片段长度多态性确定HPV基因型别：将扩增得到的PCR产物在含有限制性内切酶HpyCH4V的消化液体系下进行消化，将消化产物装载到聚丙烯酰胺凝胶上电泳；根据与限制性内切酶HpyCH4V相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

2.根据权利要求1所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，在进行步骤C后，所述用于检测HPV基因型别的方法还包括以下步骤：

对使用限制性内切酶HpyCH4V得到相似的限制性片段长度多态性图谱的HPV基因型，将其PCR产物在含有限制性内切酶CviAII的消化液体系下进行消化；根据与限制性内切酶CviAII相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

3.根据权利要求1所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，步骤B中所用的引物包括引物MY09和引物MY11；所述引物MY09的序列为CGTCCMARRGGAWAC TGATC，所述引物MY11-F的序列为GCMCAGGGWCATAAYAATGG，M为A或C，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。

4.根据权利要求1所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，所述PCR反应的热循环条件为在95℃下10分钟初始变性，随后进行35个循环，在95℃下进行15秒，50℃下30秒，和72℃下进行30秒，并在72℃下进行5分钟的最后延伸。

5.根据权利要求1所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，所述PCR反应中，PCR反应体系为25 μl，其中含有1×Ex Taq缓冲液，2 mM的氯化镁，2.5 mM的dNTP，0.5 U Ex Taq HS聚合酶，5 pmol的引物和2 μl的DNA样品。

6.根据权利要求1所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，在进行步骤B之前，还包括以下步骤：

以DNA样品作为模板，用于引物PC04和引物GH20进行PCR反应，检测DNA提取的有效性；

所述引物GH20-F的序列为GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，所述引物PC04-R的序列为CAACTTCATCCACGTTCACC。

7.根据权利要求1所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，所述消化过程中，具体为：

将6 μl 的PCR产物在20μl的消化液体系中，37℃下进行消化；其中，20 μl消化体系液含有1 U HpyCH4V和2 μl 的10×NEBuffer4。

8.根据权利要求2所述的用于检测HPV基因型别的方法，其特征在于，所述用于检测HPV基因型别的方法用于检测13种高危型HPV和20种低危型HPV；其中，13种高危型HR-HPV包括HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68；20种低危型HR-HPV包括HPV 54，85，6，69，71，72，81，53，53a，62，70，66，82，11，44，55，61，83，84，30。

9.一种用于检测HPV基因型别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

用于筛选出感染HPV病毒的DNA样本的引物；

用于限制性片段长度多态性分析的限制性内切酶HpyCH4V和CviAII。

10.根据权利要求9所述的用于检测HPV基因型别的试剂盒，其特征在于，所述用于筛选出感染HPV病毒的DNA样本的引物为引物MY09和引物MY11；所述引物MY09的序列为CGTCCMARRGGAWACTGATC，所述引物MY11-F的序列为GCMCAGGGWC ATAAYAATGG，M为A或C，W为A或T，Y为C或T，R为A或G；

所述试剂盒中还包括：

与所述限制性内切酶相对应的缓冲液；

与所述限制性内切酶相对应的酶切图谱；

用于鉴定的DNA样本中是否含有DNA的引物PC04和引物GH20；所述引物GH20-F的序列为GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，所述引物PC04-R的序列为CAACTTCATCCACG TTCACC。