[发明专利]一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒。 

背景技术

子宫颈癌是世界女性中最常见的癌症之一。每年大约有500，000个子宫颈癌的病例，其中有将近275，000个病人死于该癌症。1976年，德国学者zur Hausen 发现了人类乳头状瘤病毒（HPV）在子宫颈癌的发病过程中起到非常重要的作用。研究表明在初次感染该病毒的7到12个月内，约70％的HPV感染会被自行清除，90%在2年内被清除。其余的10%的HPV感染将会发展为持续性感染。一种高危型HPV基因型（HR-HPV）的持续性感染在子宫颈癌的发病过程中是关键的危险因素。而该癌症的发病过程往往持续10年之久。因此，早期的HPV基因型检测，尤其病毒持续性感染的检测对有效治疗子宫颈癌是至关重要的。 

目前用于检测HPV基因型别的分子生物学技术有很多。如Southern印迹直接核酸杂交测定法可以直接检测各HPV亚型，但它们耗时长，并需要大量的高度纯化的DNA，灵敏度不高。因此，它们不适合应用于大量临床样本的检测。如杂交捕获二代（HC II）的信号放大杂交试验方法已被美国食品和药物管理局（FDA）批准应用于临床试验。该方法可以检测HR-HPV 13种型别（HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，和68）。再例如靶目标放大试验，罗氏AMPLICOR HPV检测法也可以检测HR-HPV 13种型别。但是，HC II和罗氏AMPLICOR HPV检测法无法检测出特定的HPV基因型别，也就无法确定特定HPV基因型的持续性感染。基于PCR方法的直接测序法费用高昂而且低通量，不能普及。基于PCR扩增目的DNA的罗氏线性阵列HPV基因型别检测法，能区分37种HPV基因型。但是，该检测法需要使用多个特定引物进行PCR反应，在单个样本的检测种是昂贵和费时的。如HPV寡核苷酸微阵列系统和液珠GeneFinder HPV的DNA微阵列芯片分别能够检测出22种和32种HPV基因型。由于它们的准确性，其应用在发达国家很受欢迎。然而，基于芯片的检测需要非常昂贵的设备，对许多发展中国家来说可能不适合。PCR-RFLP检测法已被证明是便宜的，快速的并且准确度也高。但是，目前的PCR-RFLP基因分型方法通常同时使用多种（大约5种到6种）限制性内切酶来确定某个样本特定的HPV基因型，这使得该方法变的复杂了，无法发挥它的优势。 

因此，现有技术还有待于改进和发展。 

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测HPV基因型别的方法及试剂盒，旨在解决现有检测技术操作过程复杂的问题。 

本发明的技术方案如下： 

一种用于检测HPV基因型别的方法，其中，包括以下步骤：

A、提取DNA: 提取检测样本的基因组DNA，制得DNA样品；

B、DNA模板PCR反应：以DNA样品作为模板，采用能筛选出感染HPV病毒的DNA样品的引物进行PCR反应，扩增得到所述感染HPV病毒的DNA样品的PCR产物；

C、根据限制性片段长度多态性确定HPV基因型别：将扩增得到的PCR产物在含有限制性内切酶HpyCH4V的消化液体系下进行消化，将消化产物装载到聚丙烯酰胺凝胶上电泳；根据与限制性内切酶HpyCH4V相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，在进行步骤C后，所述用于检测HPV基因型别的方法还包括以下步骤： 

对使用限制性内切酶HpyCH4V得到相似的限制性片段长度多态性图谱的HPV基因型，将其PCR产物在含有限制性内切酶CviAII的消化液体系下进行消化；根据与限制性内切酶CviAII相应的限制性片段长度多态性图谱，确定HPV的基因型。

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，步骤B中所用的引物包括引物MY09和引物MY11；所述引物MY09-R的序列为CGTCCMARRGGAWACTGATC，所述引物MY11-F的序列为GCMCAGGGWCATAAYAATGG，M为A或C，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。 

所述的用于检测HPV基因型别的方法，其中，所述PCR反应的热循环条件为在95℃下10分钟初始变性，随后进行35个循环，在95℃下进行15秒，50℃下30秒，和72℃下进行30秒，并在72℃下进行5分钟的最后延伸。