[发明专利]一种快速高效吸附汞离子的载体及其细菌表面展示工程菌和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种快速高效吸附汞离子的载体及其细菌表面展示工程菌和应用。 

背景技术

汞污染是环境中危害最严重的重金属污染物之一。排放到环境中的汞离子极易通过细菌的作用转化为甲基汞，如不能及时清除，将会被人类通过食物链摄入，进入人脑和其他部位，导致口齿不清、手脚发抖和神经失常等机体损伤。联合国环境规划署发布的报告称我国的汞产量、需求量和排放量都是世界之最，因而成为受汞污染威胁最大的国家。其中，我国的人为排放汞总量相当于印度与美国总和的3倍，约占全球排放量的40%。化石燃料、金矿开采、金属冶炼和水泥生产是我国汞排放最主要的几个来源。 

虽然工业上有很多传统方法如化学沉淀法、离子交换法、吸附法等都可以去除水环境中的重金属,但是近年应用微生物从废水中生物吸附或富集重金属的新工艺比传统的去除方法显示出了更为优越的性能。生物吸附法具有吸附介质来源丰富、操作简单、吸附速率快等优点。随着近年来分子生物学技术的飞速发展,运用基因工程技术构建具有超强富集能力及高选择性的基因重组微生物，是重金属废水生物处理和重金属资源合理利用的新的发展方向。有研究者将带有汞操纵子和金属硫蛋白编码基因、豌豆金属硫蛋白融合基因、谷胱甘肽与金属硫蛋白融合基因、植物螯合肽与麦芽糖融合蛋白(MBP-EC20)等的重组DNA质粒转化到大肠杆菌（E．coli）JM109中，得到了从废水中富集汞离子能力强的基因工程菌。基因工程菌对汞离子具有很强的选择特异性和亲和性。因此现阶段需要提供更能够快速高效吸附汞离子的基因工程菌。 

发明内容

本发明目的在于一种快速高效吸附汞离子的基因工程菌的构建及其应用。 

为实现上述目的，本发明的技术方案为： 

一种能够吸附汞离子的载体以含有自转运蛋白的分泌序列的载体pBAT作为一种表面展示工具，奇异变形杆菌的谷胱甘肽转移酶连接到ScaI内切酶处理过的pBAT载体中，即得到吸附汞离子的载体（质粒载体pBATGst）。 

快速高效吸附汞离子的细菌表面展示工程菌，采用细菌表面展示的方式，通过信号传递系统，含有自转运蛋白的分泌序列的载体pBAT将谷胱甘肽转移酶（GST）锚定在宿主菌表面，即得到吸附汞离子细菌表面的工程菌（Top10/pBATGst）。 

快速高效吸附汞离子的细菌表面展示工程菌的构建方法， 

1）质粒载体pBATGst的构建： 

a.将质粒pBAT用限制性内切酶ScaI处理，用去磷酸化酶去掉酶切位点暴露的磷酸基团； 

b.采用奇异变形杆菌作为模板，以引物GSF3和GSR3进行PCR扩增，扩增产物纯化，而后与ScaI处理过的pBAT载体在室温条件下连接2小时，即得到质粒载体pBATGst； 

2）Top10/pBATGst工程菌的构建 

将上述所得连接处理混合液质粒载体pBATGst转化大肠杆菌Top10，并在在含有100μg/ml氨苄青霉素（ampicillin，Ap）的LB固体培养基上培养筛选含有目的插入片段的重组转化子，即为Top10/pBATGst。 

所述引物GSF3和GSR3分别为GSF3:（5’-ATGATCGATCTTTATTATGCAAACAC-3’）和GSR3:（5’-ACCAAACAGTTTTTTGGCTGC-3’）。 

所述PCR条件：94℃60s,然后94℃40s,57℃60s,72℃60s,30个循环后再72℃延伸反应10min； 

PCR体系为50μl，其中包括H₂0，37.5μl；10×PCR缓冲液，5μl；dNTP，4μl；GSF3:1μl；GSR3:1μl；Template，1μl；酶，0.5μl。酶为能PCR出平末端DNA产物的pfu酶。 

快速高效吸附汞离子的细菌表面展示工程菌的应用，所述工程菌可用于吸附环境中的汞离子。 

所述工程菌可用于吸附水环境中的汞离子。所述工程菌吸附的汞离子，经pH的调节后可将汞离子解吸附后回收再利用。 

将所述吸附了汞离子的工程菌重悬于不同pH（pH为3-11）的BR（Britton-Robison）缓冲液中，室温晃动混匀后离心，取上清即为回收的汞离子。 

将所述吸附了汞离子的工程菌重悬于pH为3-11的BR（Britton-Robison）缓冲液中，室温晃动1-5小时混匀后离心，取上清即为回收的汞离子。