[发明专利]仿刺参检测引物、试剂盒及实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于海参基因检测技术领域，具体涉及一种仿刺参检测引物、试剂盒及实时荧光PCR（Real time fluorescence PCR）检测方法。

背景技术

海参隶属于棘皮动物门海参纲，是海洋中一类无脊椎动物的总称。根据Pawson et Fell分类系统的划分原则，整个海参纲包含3亚纲、6目、24科。迄今为止，在全世界范围内已发现900余种海参，其中40余种在人类社会具有长期食用的记录，因此可作为食用海参^[1][2][3]。仿刺参（Apostichopus japonicus）俗称辽参，从属于楯手目、刺参科、仿刺参属，是我国经济价值最高的海参品种。其种群主要分布于辽、冀、鲁、苏等北方沿岸浅海区，在日本北海道、俄属海参崴、朝鲜半岛也有生长^[2]。仿刺参线粒体的遗传方式为经典的母系遗传，不存在父本杂交^[4]，因此线粒体DNA可作为仿刺参鉴定的上佳分子生物学材料。仿刺参线粒体DNA序列全长16096bp，共编码13个蛋白基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因^[5]。其中，COX1基因与16S rRNA基因是目前海参鉴定研究中应用最广泛的序列。

我国对仿刺参的检测技术仍处于比较落后的阶段，检验方法步骤繁琐，灵敏度低；对于检验人员专业能力要求高且易受主观经验影响。海参的外部形态与骨片特征是传统鉴定的主要依据。廖玉麟等根据传统鉴定方法对我国134种海参进行了详尽的统计^[2]。然而，目前的商品海参通常经过蒸煮、腌制、烘烤、晒干等加工过程，最终以干品形式进行销售。因此，商品海参与活体海参在外部形态上存有较大差异。骨片指的是海参真皮表层所包含的内骨骼，其形状、大小常随种类而异，因此成为了海参种类鉴定的主要手段^[2]。但是，某些海参并非仅具有唯一一种骨片样式，例如Stichopus chloronotus（绿刺参）、Athyonidium chilensis（智利海参）就存在3种类型的骨片，而Holothuria edulis（红腹海参）甚至含有4种骨片样式^[6]。因此，应用传统方法鉴定海参的工作仅限于具有丰富鉴别经验的专业人员。

分子生物学技术是目前物种鉴定领域中应用最为广泛的一类方法，能够有效地解决生物体表现型无法真实反映物种种类的问题。目前，已有许多研究采用了分子生物学技术对海参进行物种鉴别。2008年，梁君妮等根据海参COX1基因与16S rRNA基因分别设计引物，采用普通PCR、克隆、测序等技术鉴别了包括仿刺参在内的11种海参^[7]。2011年，文菁等应用3种核酸内切酶对海参16S rRNA基因片段的PCR产物进行酶切，建立了应用PCR-RFLP技术鉴定16种海参的方法^[8]。2011年，律迎春等应用普通PCR、硝酸纤维素膜斑点杂交技术对仿刺参进行特异性的鉴定，并初步验证了斑点杂交方法应用于海参品种鉴定的可行性^[9]。然而，时效性与准确性是评价一种检测手段最重要的参考指标。与前述方法相比，荧光PCR技术显然有着无可比拟的优势。

发明内容

本发明应用实时荧光PCR技术，建立了一种快速检测仿刺参的方法。整个检测过程可在120分钟之内完成，其中人工操作时间不足60分钟。此方法既克服了传统海参鉴别的局限性，同时又结合了荧光PCR技术高效率、低污染的优点，在仿刺参的真伪鉴别中具有广泛的应用前景。

本发明的技术方案为：基于仿刺参线粒体COX1基因、NAD4基因设计体系1、体系2、体系3，采用荧光PCR技术中的探针法（probe）进行仿刺参的特异性鉴定实验。实施例中的结果表明，上述3个检测体系均能从12种海参中特异性的鉴别仿刺参。同时，本发明基于12种海参线粒体16S rRNA基因设计体系4、体系5，采用荧光PCR技术中的Green I嵌合荧光法对海参核酸提取情况进行监测。实施例的结果表明，上述2个检测体系均可监测12种海参的提取情况。此外，本发明评价了5个检测体系的重复性，其中体系1、体系2、体系3、体系4、体系5的变异系数分别小于4%、2%、2%、3%、4%，表明本发明设计的5个检测体系具有良好的重复性。

本发明的一方面在于：公开一种仿刺参检测引物，其至少包括下述扩增引物组中的一组：SEQ ID NO.1～3、SEQ ID NO.4～6、SEQ ID NO.7～9。