[发明专利]一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法有效

专利信息
申请号: 201310276185.4 申请日: 2013-07-03
公开(公告)号: CN104280366B 公开(公告)日: 2017-10-10
发明(设计)人: 鲁伯埙;胡朝阳 申请(专利权)人: 复旦大学
主分类号: G01N21/64 分类号: G01N21/64
代理公司: 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙)31268 代理人: 吴桂琴
地址: 200433 *** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 通量 检测 化合物 靶标 蛋白 方法
【说明书】:

技术领域

本发明属生物化学领域,涉及细胞水平的高通量筛选技术,特别涉及一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法。本方法基于能量转移均相时间分辨荧光共振的高通量检测技术,用于快速寻找化合物靶蛋白。

背景技术

生物信息学与制造科学相结合,是二十一世纪推动生命科学发展的最重要动力。现有技术公开了药物靶标(drug target)是指细胞内与药物相互作用,并产生药物效应的细胞内特定分子。98%以上的药物靶标属于蛋白质。研究显示,只要找到了药物作用的靶标分子就能根据其特点开发和设计药物,以及进行靶向治疗。近年来大量分子生物学技术的出现,尤其是基因组学、生物信息学、蛋白质组学、质谱联用技术及生物大分子相互作用分析技术(BIA)等推动了从纷繁复杂的细胞内生物大分子中发现特异性的药物作用靶标分子的进程。本领域研究中,通过发现药物靶标进行开发和设计特异性药物是创新性药物研发的重要途径。据了解,目前已发现药物中有接近一半并不清楚其药靶。在中国,绝大多数的有效中药的活性分子的药靶也未知。本领域技术人员知晓,明确药物药靶对明确其治疗机理、发现其新的适应症有着至关重要的作用。

均相时间分辨荧光(HTRF)是用于检测均相体系中待测物的一种最常用的技术,该技术结合荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨技术(TR),其基本原理是,当供体和受体相离很近时(小于10nm),在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰,最终得到的信号跟产物形成的量成比例。TR-FRET技术的应用加快了很多基于抗体的研究,包括GPCR(配体结合,受体二聚化,cAMP 和IP-1的检测,以及磷酸化ERK的定量),激酶,细胞因子和生物标志物,生物过程(抗体和蛋白生产),以及蛋白和蛋白,蛋白和多肽,蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。HTRF也是基于TR-FRET的化学技术,但它的许多特点把它与其他TR-FRET产品区分开来。其中一个特点就是由于使用了镧系元素,从而具有非常长的半衰期(铕和铽),镧系元素与络合的穴相结合,这种结合的穴状物与其他所有TR-FRET产品使用的螯合技术相比能增加实验的稳定性,另外使用专利化的比值测量能矫正干扰因素。此外,HTRF技术还有以下优势:均质性(不需要洗板)、低背景、实验体积小型化和实验步骤简捷化、培养基的干扰小、与大部分酶标仪相兼容。

本申请的发明人拟提供一种为化合物的靶标发现提供新型快速、准确高效的高通量筛选手段。

发明内容

本发明的目的克服现有技术的缺陷,提供一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法。本方法基于能量转移均相时间分辨荧光共振的高通量检测技术,用于快速寻找化合物靶蛋白。

本发明方法基于:将蛋白和化合物标记后,利用HTRF技术高通量检测其相互作用,筛选药靶;其中,当特定蛋白和化合物想结合,通过HTRF产生荧光共振信号,被高通量识别,否则无信号;本发明方法采用与HTRF荧光标记结合的高通量筛选技术,在人类全基因表达库的基础上,能为化合物的靶标发现提供新型快速、准确高效的高通量筛选手段。

本发明方法主要步骤包括:(1)构建成加蛋白标签的文库(library),即先给单个基因表达序列加上标签A,之后构建全基因组的基因过表达质粒,形成library;(2)将目的化合物加可被识别的标签B;(3)将library中的基因表达质粒转染进高通量介质的细胞中,用加标签B的化合物进行处理,最后用HTRF进行筛选细胞中与之结合的化合物靶蛋白。

具体的,本发明的一种高通量检测化合物的靶标蛋白的方法,其特征在于,其包括步骤:

(1)构建携带荧光标签的蛋白文库;

(2)为待检测化合物增添可识别的标签;

(3)将构建的待测化合物与蛋白文库进行共孵育,使化合物与文库蛋白进行充分的结合;

(4)利用均相时间分辨荧光共振原理(HTRF)对加标签化合物和文库蛋白结合能力检测。

本发明中,将待测化合物标记后,与人类全基因组表达的蛋白文库进行亲和力检测。

本发明中,采用构建的人类全基因库,为每组基因增加荧光标签(例如HA-lag),构建全基因组的基因过表达质粒,形成蛋白文库;

本发明方法步骤(2)中,将根据待测试化合物的溶解性、极性和其他物理性质,选择与其匹配的标志物(例如生物素),根据标志物的特点选择孵育条件,得到携带可被识别标签的化合物;

本发明中,将构建的待测化合物与蛋白文库进行共孵育,使二者得到充分的结合,为后续的荧光共振能量转移提供反应条件;

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