[发明专利]一种水稻基因组定点改造方法

权利要求书

1.一种实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于：所述方法包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过水稻细胞的自身DNA修复功能，最终实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失；

所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；

所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。

2.一种实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于：所述方法包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA、Cas9核酸酶和单链寡核苷酸DNA，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过同源重组，最终实现水稻目的基因的靶标片段中插入已知序列DNA；

所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30；

所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合；

所述单链寡核苷酸DNA依次由同源臂A、所述已知序列DNA、同源臂B连接而成；同源臂A的序列与目的基因上靶标片段的上游序列相同，同源臂B的序列与目的基因上靶标片段的下游序列相同。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述5’-N_X-NGG-3’中，19≤X≤21，具体X为20。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-N_X-NGG-3’中NX片段互补结合的RNA片段。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述向导RNA中骨架RNA片段是由SEQ ID No.3中第411-493位核苷酸所示DNA转录出来的RNA。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向水稻组织中直接转入所述向导RNA和带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向水稻组织中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体，所述向导RNA的表达盒在水稻组织中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因在水稻组织中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述向导RNA的表达盒由U3启动子和所述向导RNA的编码基因组成；所述向导RNA的编码基因由所述能与所述靶标序列互补结合的RNA片段的编码基因和所述骨架RNA片段的编码基因组成。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述向导RNA的表达盒中启动子为U3启动子时，所述靶标片段的一条链具有如下结构：5’A-N_X-NGG-3’，N及X与权利要求1或2中定义相同。

10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因中，所述Cas9核酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中第37-4161位核苷酸所示。