[发明专利]一种水稻基因组定点改造方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种水稻基因改造方法。 

背景技术

水稻是世界上最重要且广泛种植的农作物之一，对水稻基因组的改造有利于提高产量，增强其对病虫害的抗性和逆境抵御能力，对农业发展有重要意义。目前的基因组工程（Genome engineering）技术中，主要通过锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）来做基因改造。但是将这些技术用于水稻基因定点改造，操作过程复杂，成本较高，技术难度较大，因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的水稻基因改造新技术。 

最近发现的原核生物的第二类适应性免疫系统CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）提供了另一个基因组工程的方法。第二类CRISPR系统广泛存在于细菌中，它们利用一个核酸内切酶Cas9为它们自身提供了防御病毒和质粒入侵的手段。Cas9可以和一个人工合成的向导RNA（guide RNA，gRNA）组成复合体，向导RNA由crRNA（CIRSPR RNA）和tracr RNA（trans-activating crRNA）融合产生。由gRNA引导Cas9核酸内切酶识别并切断靶位点DNA序列。Cas9有两个关键的结构域：HNH和RuvC，它们分别切开DNA双链中的一条单链。产生DNA双链断裂（DSB），细胞启动修复机制，通过非同源末端连接（NHEJ）这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变，通过同源重组（HR）方式修复可以实现精确的基因定点插入或基因替换。该系统已经在细菌、人类细胞、斑马鱼和小鼠中成功进行基因组工程研究。 

发明内容

本发明提供了一种水稻基因组定点改造方法。 

本发明的一个目的是提供一种实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法。 

本发明所述的实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，可包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过水稻细胞的自身DNA修复功能，最终实现水稻目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失； 

所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30； 

所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。 

本发明的另一个目的是提供一种实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法。 

本发明所提供的实现水稻目的基因中靶标片段中定点插入已知序列DNA的基因改造方法，是利用gRNA：Cas9系统在水稻中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，该方法可包含以下步骤：使水稻组织中含有向导RNA、Cas9核酸酶和单链寡核苷酸DNA，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过同源重组，最终实现水稻目的基因的靶标片段中插入已知序列DNA； 

所述靶标片段位于所述目的基因上；所述双链靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-N_X-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30； 

所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA,所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合。 

所述单链寡核苷酸DNA依次由同源臂A、所述已知序列DNA、同源臂B连接而成；同源臂A的序列与目的基因上靶标片段的上游序列相同，同源臂B的序列与目的基因上靶标片段的下游序列相同。 

具体的，所述同源臂A和所述同源臂B的长度各为30bp。 

所述方法中，所述5’-N_X-NGG-3’中，19≤X≤21，具体X为20。 

所述方法中，所述向导RNA中能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-N_X-NGG-3’中N_X片段互补结合的RNA片段。