[发明专利]一种耐胃酸EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法

权利要求书

1.一种EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，参照GenBank中EGFP序列，用Oligo6.0设计一对引物，由北京华大基因合成如下：Sense：5＇-CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3＇，Anti-sense：5＇-GTCGTCGACGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3＇；经EGFP序列的PCR扩增，用DNA纯化试剂盒回收后待用；其特征在于：分步骤实施；

步骤1原核表达载体PET28a-EGFP的构建

其1EGFP片段和PET28a质粒经BamH I和Sal I双酶切后，切胶纯化回收目的基因和载体片段，用T4DNA Ligase16℃恒温过夜连接，转入BL21感受态细胞中，涂布于LB固体培养基，即含Kan，50μg/ml，正置20min后，37℃培养12h；

其2EGFP扩增产物的双酶切反应体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamHⅠ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒5.0μl，加ddH₂O补足至20.0μl；37℃水浴4h；

其3PET28a质粒双酶切体系及反应条件：10×H Buffer2.0μl，BamH Ⅰ1.0μl，SalⅠ酶1.0μl，pGM-EGFP质粒7.0μl，加ddH₂O补足至20μl；37℃水浴4h；

其4连接体系及反应条件：pGM-EGFP质粒双酶切纯化回收产物1.0μl，PET28a质粒双酶切纯化回收产物5.0μl，10×T₄DNA Ligase Buffer1.0μl，T₄DNALigase1.0μl，加ddH2O补足至10.0μl；混匀后16℃,水浴12h；

步骤2SDS-PAGE电泳蛋白诱导表达：SDS-PAGE电泳为诱导阳性，出现29.2KDa的His-tag-EGFP融合蛋白特异性条带；

步骤3显微镜检测EGFP基因表达：40倍暗视野UV激发下，平板上的菌落发绿色荧光；

步骤4GFP标记稳定性：30代次中菌体生长良好，仍能在12h内长出较大的菌落，其Kan抗性维持在50mg/L；

步骤5EGFP BL21重组菌微囊包被：将GFP标记的重组菌以2%接种到LB液体培养基内，37℃，150rpm振荡培养至OD=1.60，然后将菌液加至2-3%海藻酸钠溶液中，并加入6%吐温80，3000rpm，搅拌30min；将配制的海藻酸钠溶液、乳化剂、保护剂及灭活菌液依次加入组织捣碎机高速乳化10min，将乳化好的溶液置于高压均质机中10000rpm、50-60℃、均质30min，将脱气后的均匀乳状液通过内径约为0.8mm的硅胶管，连通蠕动泵以50-70ml/min的速度泵入喷雾干燥机内进行喷雾干燥。

2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于：实验选用2%和3%浓度的海藻酸钠作为壁材，具有良好的抗胃酸的效果。