[发明专利]一种耐胃酸EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制剂，研制的EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌，对兽类消化道微生物代谢规律的研究起到示踪作用。 

背景技术

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，最初是由Shimomure从多管水母属(Aequorea victoria)中分离出来的，由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构，由238个氨基酸组成，其特点是发色团为GFP蛋白质一级结构序列所固有，无需底物或辅因子就可在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，由于其检测方便，无种属特异性，且对活细胞无伤害，已被作为一种标记基因广泛应用于生物学的各个领域作为报告基因。虽然氯霉素转乙酰基酶（CAT）、β－半乳糖苷酶、碱性磷酸酶（AP）等标记物已得到广泛应用，但是这些标记物需要底物或辅助因子的作用才能显色，在标记研究中需要裂解或固定细胞，敏感性不高，不能在显微镜下直接进行活体细胞的研究，与其相比，EGFP克服了前述的诸多不足，因而被广泛应用于生物学标记领域。 

EGFP标记系统和荧光显微镜的出现,使研究者能够对微生物和宿主相互作用过程进行长期的定位监测。有文献检索披露：①杨震元等利用草胺磷抗性和GFP双筛选标记，将重组质粒pbarGPEI－GFP，转入金龟子绿僵菌RCEF3377后，诱导表达。并将双标记的金龟子绿僵菌袍子粉配制成种衣剂，观察玉米苗期根部定殖情况，结果表明金龟子绿僵菌袍子在玉米根部活力和定殖力高。②彭祎等采用电转化法将绿色荧光标记的质粒导入pB-SVG101，将稳定表达的荧光标记多粘芽孢杆菌菌株，用于番茄根际土壤中的迁移和定殖规律的研究。发现该菌株能通过浸根的方式侵入番茄的维管组织和周围细胞。③李春强等利用荧光共聚焦显微镜观察转入绿色荧光蛋白基因的西瓜尖孢镰刀菌FON侵染西瓜的过程，结果发现在1/2MS培养的西瓜苗中，FON48h即可侵染进入西瓜的根维管束，第3d便可进入茎维管束，第4d进入叶维管束（包括叶柄和叶脉），而土壤盆栽条件下的西瓜苗，侵染后，每2d FON才进入西瓜的根维管束，9d进入茎维管束，第11d进入叶维管束，即与土壤盆栽相比，培养基培养栽培的西瓜苗，FON侵染的速度较快。 

微胶囊技术是指利用天然或合成高分子材料，将分散的固体、液体，甚至是气体物质包裹起来，形成具有半透性或密封囊膜的微小粒子的技术，包囊的过程即为微胶囊化(microen-capsulation)。现代高分子材料研究和科学技术的发展，使微囊化技术的制备工艺、制备技术更加成熟、多样，现在微囊化的口服制剂的研发更加趋向于定时定点，定量，高效释放。影响微囊释放的因素较多，影响过程也比较复杂。文献披露：①吴菁菁等采用了高效液相色谱法测定壳聚糖-海藻酸钠黄芩微囊累积释放量。②李晔等以带有正电的罗丹明6G分子、带有负电荷荧光素分子、中性的尼罗红分子和生物分子R-藻红蛋白为模型分子。③孙梅等还发现，相比明胶和淀粉，海藻酸钠作为壁材的酪酸菌微胶囊在人工胃液中具有很好的耐胃酸性，而在人工肠液中，具有较好的溶出性。 

本发明以EGFP作为荧光标记物标记，并将其用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，通过体外模拟消化道内环境，研究微囊化缓、控释制剂在体内的消化代谢规律。 

发明内容

本发明的目的在于：以EGFP作为荧光标记物标记，并将其用耐酸性材料海藻酸钙微囊化包被后，作为一种示踪剂，对兽类体内的消化代谢规律研究，具有重要的实践价值。 

本发明的目的是这样实现的：一种EGFP标记大肠杆菌BL21消化道示踪菌制备方法，分步骤实施； 

步骤1参照GenBank中EGFP序列，用Oligo6.0设计一对引物，由北京华大基因合成；其Sense：5＇-CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3＇，Anti-sense：5＇-GTCGTCGACGCTTGTACAGCTCGTCCATG-3＇； 

其中EGFP序列的PCR扩增 

PCR反应体系：5.0μl10×PCR Buffer，4.0μl dNTP，1.0μl PEGFP-C₁质粒模板，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，0.25μl Tap Polymerase，加ddH₂O水至50μl，PCR仪中扩增；