[发明专利]一种层层自组装法双重修饰脂质体的制备方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种层层自组装的双重修饰脂质体的制备方法，可进一步应用于食品、药品、化妆品等领域。

背景技术

脂质体(liposome)是由磷脂双分子层形成的内部包含水相的封闭囊泡，具有缓释性，细胞亲和性，组织相容性和靶向性等优点，已成功应用于生物医药、化工农业等领域。脂质体用于包裹营养素、酶、食品添加剂、食品抗菌剂等食品运载体系显示出诱人前景，然而脂质体作为一种微粒分散体系,在贮藏过程中存在着颗粒絮凝、粒径易变大、药物渗漏等问题。近年来，为了增加脂质体双层膜结构和体内外释放的稳定性，通过物理化学作用在脂质体表面包覆蛋白、多糖或者其他物质来修饰脂质体的研究成为热点。

自组装技术是分离或交联的组分在适当条件下自发地形成有序结构的过程，层层自组装技术是基于溶液中带有相反电荷的物质交替吸附形成自组装多层膜，由于这种技术操作条件的温和性（室温，常压和在水溶液中进行）和对物化性质的可控性，使得其发展迅速。壳聚糖和海藻酸钠是存在于自然界中天然线性多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性，可作为脂质体安全的修饰剂材料。

本发明在采用薄膜分散-动态高压微射流技术制备纳米脂质体（NL）的基础上，进一步采用聚电解质层层自组装技术，以海藻酸钠(sodium alginate, 简称AL)中分子链上大量的羧基为负电荷，以壳聚糖(chitosan，简称CH)分子链上大量的伯氨基为正电荷，通过正、负电荷静电作用层层交替形成聚电解质膜，组装在纳米脂质体模板表面。从而制备海藻酸钠、壳聚糖双重修饰脂质体（AL-CH-L）。

发明内容

本发明的目的是为提高脂质体的稳定性，提供一种实用、安全、制备简易的层层自组装双重修饰脂质体，为后期进一步扩展脂质体的应用提供基础。

本发明的具体工艺步骤如下：

（1）各原料的重量百分比为：卵磷脂为4.0%-8.0%，胆固醇为0.8%-1.2%，吐温-80为1.5%-2.5%，维生素E为0.1%-0.3%，其余的是浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液即PBS，为86.0%-93.1%，此外使用的壳聚糖和海藻酸钠溶液浓度分别为0.6%，0.5%；

（2）按上述重量百分比称取卵磷脂、胆固醇、吐温-80和维生素E，在40℃条件下，先用0.206g卵磷脂溶于10ml无水乙醇后，完全溶解各组分；

（3）将步骤（2）中所得溶液于真空旋转蒸发仪上除去无水乙醇，形成均匀薄膜；

（4） 按8%脂质浓度即卵磷脂与胆固醇总量占缓冲溶液体积的百分比，加入30mlpH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲溶液即PBS洗膜，形成粗脂质体悬浊液；

（5）用动态高压微射流即DHPM处理步骤（4）得到的粗脂质体悬浊液，压力为120MPa，处理次数为2次，得纳米脂质体；

（6）将步骤（5）得到的纳米脂质体按照体积比1：1，逐滴加入至0.6%的壳聚糖即CH溶液中，利用HCl、NaOH稀溶液调节pH至5.5，室温搅拌1h后静置1h，得到第一层修饰的壳聚糖-脂质体即CH-L。

（7）将步骤（6）得到的CH-L按照体积比1:1逐滴加入到0.5%的海藻酸钠即AL溶液中，利用HCl、NaOH稀溶液调节pH至5.5，室温搅拌1h后静置1h，3000g离心15min除去沉淀，过滤得到双重修饰的海藻酸钠-壳聚糖-脂质体即AL-CH-L。

本发明的有益效果是：

（1）粒径和电位：未修饰的纳米脂质体（NL）平均粒径为79.83±3.83nm，分散系数为0.23±0.008，zeta电位为-6.74±1.22mV；制备的层层自组装双重修饰脂质体（AL-CH-L）平均粒度为330.6±37.3nm，分散系数为0.65±0.048，zeta电位为-15.79±0.697mV。

（2）微观形貌：未修饰的纳米脂质体和双重修饰脂质体的原子力显微镜3D形貌如图3所示，可看出制备的未修饰的纳米脂质体（NL）颗粒清晰，大小及分布比较均匀（如图3a）；而制备的层层自组装双重修饰脂质体（AL-CH-L）粒径较大，除了突起的大颗粒AL-CH-L外，还有分散着一些AL和CH附着物（如图3b）。通过透射电镜观察得到的未修饰的纳米脂质体和双重修饰脂质体微观形貌如图4所示。未修饰纳米脂质体呈球形，并且分布较均匀，成型较好（如图4a）；而双重修饰脂质体AL-CH-L呈球形，结构完整，粒径明显大于未修饰的脂质体，并且呈现出典型的核-壳结构，内层为饱和度较高的亮白色，外层覆盖上较为透明的聚合物层（如图4b）。