[发明专利]利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法

权利要求书

1.一种利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）将内皮细胞包埋于基质中，待内皮细胞与基质均匀混合后，混合比例按100微升液态基质中混合1′10³～1′10⁶细胞，将内皮细胞及基质的混合物覆盖在Transwell嵌套聚碳酸酯膜的下表面，然后将Transwell嵌套置于室温下进行自然固化或者通过将嵌套放置在37℃温箱中固化；

（2）固化完成后，翻转Transwell嵌套并将其置于普通多孔细胞培养板的无血清细胞培养液中，然后在嵌套上方加入事先经荧光标记的待测细胞悬浮液；经过一定的侵袭时间，除去嵌套上方未侵袭的细胞，用适当的酶消化细胞外基质至液态，通过离心收集其中的细胞，包括未标记的内皮细胞以及侵袭入基质已标记的待测细胞，然后用小量PBS悬浮收集到的细胞，并将其中的一部分放入Terasaki板中，置于荧光显微镜下进行图片采集以及后续分析。

2.根据权利要求1所述的利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法，其特征在于，该方法使用Lewis肺癌细胞和原代人类肺部淋巴管内皮细胞，其具体步骤如下：

（1）培养Lewis肺癌细胞和原代人类肺部淋巴管内皮细胞；

将Lewis肺癌细胞培养在含有10%热灭活胎牛血清和1′细胞培养用青霉素－链霉素的DMEM培养液中，每隔2-3天用胰酶消化并按照1:6～1:10的比例进行传代培养；

将原代人类肺部淋巴管内皮细胞培养在内皮细胞培养液中，每隔2-3天用胰酶消化并按照1:3～1:5的比例进行传代培养；用于侵袭的细胞选自在第3-7代之间；

（2）将内皮细胞与细胞基质的混合物完全覆盖Transwell嵌套聚碳酸酯膜的下表面，其具体步骤如下：

a.用不含血清的内皮细胞培养液将pH 6.9～7.4，5 mg/mL的 I型牛胶原在冰上稀释至3 mg/mL，然后将稀释胶原加入到离心后的沉淀内皮细胞团中用移液枪将两者均匀混合；

b.取Transwell嵌套将其翻转置于一干净的托盘上，用移液枪吸取100 mL内皮细胞稀释胶原混合物并将其完全覆盖于Transwell嵌套聚碳酸酯膜的下表面，覆盖完成时，细胞胶原混合物在聚碳酸酯膜的下表面上形成穹窿状；将嵌套送入37℃无菌细胞培养箱中聚合固化5-6小时，随时间进行，聚碳酸酯膜的下表面上的细胞胶原混合物将逐渐变平；

（3）将待测Lewis肺癌细胞加入到Transwell嵌套内；

待细胞胶原混合物聚合固化完成后，将其从细胞培养箱中取出，翻转并置于含有37℃预热无血清细胞培养液的24孔细胞培养板中，用同样的无血清细胞培养液悬浮待测并实现用荧光标记好的Lewis肺癌细胞，将100 mL肺癌细胞悬浮液转移到Transwell嵌套内，盖上细胞培养板的盖子，并将其送回细胞培养箱中；侵袭过程为18-24小时；

（4）采集侵袭细胞数据；侵袭结束后，用移液枪将嵌套内的细胞液以及未侵袭的细胞移除并丢弃，将Transwell嵌套从原24孔板转移到一个新的24孔板中，在这个新的24孔中加入0.2%I型胶原酶；然后将24孔板放入37℃摇摆温箱中，摇摆30分钟到1小时，直至胶原完全溶解；将液态溶解胶原以及其中包含的细胞转移到1.5 mL Eppendorf管中，在500′ g速度下离心5分钟，弃掉上清液，用PBS充分悬浮沉淀细胞团，用移液枪转移1.5 mL细胞悬浮液到96孔Terasaki板中，置于荧光显微镜下经行荧光细胞图像拍摄；然后用NIH ImageJ软件对每个图片中的荧光细胞数量进行分析测量。