[发明专利]利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测量细胞侵袭性的方法，特别是一种利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法。

背景技术

细胞迁移是由多步骤组成的，高度协调统一的生物过程。细胞侵袭与细胞迁移密切相关，其过程主要涉及细胞在细胞基质中的移动，即细胞迁移以及细胞外基质的降解和蛋白质的水解。细胞迁移和细胞侵袭在各种生理以及病理过程，例如胚胎发育，组织修复，癌症转移，动脉粥样硬化，关节炎，哮喘等中起到极其重要的作用。因此，研究各种不同类型的细胞在不同环境下的迁移和侵袭行为以及参与其中的分子调节机制将会为有效控制和治疗各类疾病提供重要的线索以及解决方案。

为了能够直观定量地研究细胞迁移和细胞侵袭并有效控制各个潜在因素在其中的作用，多种体外试验系统已经被建立起来了，其中应用最为广泛的当属Transwell试验体系。该体系的主要构成包括常规使用的多孔细胞培养板和可插入其中的圆柱形的细胞培养嵌套，每个嵌套的底部由固定孔径的聚碳酸酯膜覆盖。为了定量测量细胞迁移的活性，待测细胞悬浮液被加入到嵌套聚碳酸酯膜的上方，而在多孔细胞培养板中加入感兴趣的化学信号，例如细胞趋化因子等。经过一定时间的培养，进入到嵌套下方，即细胞培养板中的待测细胞就代表了发生迁移的细胞。然后通过荧光标记，染色或洗脱迁移细胞等方法可对迁移细胞进行量化。当利用Transwell系统进行细胞侵袭研究时，通常会首先将细胞基质均匀覆盖在聚碳酸酯膜的上方或下方，这样进入到多孔细胞板中的待测细胞就必须浸润并穿过细胞基质。 

尽管以上系统已经为研究细胞迁移和侵袭的机理机制提供了非常宝贵的信息，但是这些系统都存在着各自的弊端和缺陷。例如细胞迁移试验忽略了细胞外基质的重要性，而现有的细胞侵袭试验无法用于研究多类型细胞之间的相互作用以及某些分泌因子在细胞外基质中的分布对于细胞侵袭的影响。

发明内容

 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供方法设计更为科学、有效改良并扩展Transwell实验技术的应用范围的新方法，该方法可利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质的侵袭性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）将内皮细胞包埋于基质中，待内皮细胞与基质均匀混合后，混合比例按100微升液态基质中混合1×10³～1×10⁶细胞，将内皮细胞及基质的混合物覆盖在Transwell嵌套聚碳酸酯膜的下表面，然后将Transwell嵌套置于室温下进行自然固化或者通过将嵌套放置在37℃温箱中固化；

（2）固化完成后，翻转Transwell嵌套并将其置于普通多孔细胞培养板的无血清细胞培养液中，然后在嵌套上方加入事先经荧光标记的待测细胞悬浮液；经过一定的侵袭时间，除去嵌套上方未侵袭的细胞，用适当的酶消化细胞外基质至液态，通过离心收集其中的细胞，包括未标记的内皮细胞以及侵袭入基质已标记的待测细胞，然后用小量PBS悬浮收集到的细胞，并将其中的一部分放入Terasaki板中，置于荧光显微镜下进行图片采集以及后续分析。

本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的利用Transwell测量多种细胞对包埋有内皮细胞的细胞基质侵袭性的方法，其特点是，该方法使用Lewis肺癌细胞和原代人类肺部淋巴管内皮细胞，其具体步骤如下：

（1）培养Lewis肺癌细胞和原代人类肺部淋巴管内皮细胞；

将Lewis肺癌细胞培养在含有10%热灭活胎牛血清和1×细胞培养用青霉素－链霉素的DMEM培养液中，每隔2-3天用胰酶消化并按照1:6～1:10的比例进行传代培养；

将原代人类肺部淋巴管内皮细胞培养在内皮细胞培养液中，每隔2-3天用胰酶消化并按照1:3～1:5的比例进行传代培养；用于侵袭的细胞选自在第3-7代之间；

（2）将内皮细胞与细胞基质的混合物完全覆盖Transwell嵌套聚碳酸酯膜的下表面，其具体步骤如下：

a.用不含血清的内皮细胞培养液将pH 6.9～7.4，5 mg/mLr的 I型牛胶原在冰上稀释至3 mg/mL，然后将稀释胶原加入到离心后的沉淀内皮细胞团中用移液枪将两者均匀混合；