[发明专利]一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法

权利要求书

1.一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点饱和突变获得的酶突变体，其中突变位点为116位的Trp。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述116位的Trp突变为Ala、His或Phe。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2、SEQ NO.3或SEQ NO.4。

4.一种利用权利要求1～3任意一项突变体制得的突变质粒。

5.权利要求4所述突变质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；

（2）将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到突变质粒。

6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR的引物序列如下：

SMG For           5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’

3'AOX             5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’

Trp116His For     5’-GATGCGAAGTTCCATCAAGAAGAC-3’

Trp116His Rev     5’-GTCTTCTTGATGGAACTTCGCATC-3’

Trp116Phe For     5’-GATGCGAAGTTCTTCCAAGAAGAC-3’

Trp116Phe Rev     5’-GTCTTCTTGGAAGAACTTCGCATC-3’

Trp116ala For     5’-GATGCGAAGTTCGCGCAAGAAGAC-3’

Trp116ala Rev     5’-GTCTTCTTGCGCGAACTTCGCATC-3’

7.一种重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求4的含有突变体基因的质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；

（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33（Pichia pastoris）。

9.权利要求7或8所述方法制备的重组菌株。