[发明专利]一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及制备方法，还涉及该突变体的重组菌株。

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3）不仅能催化水解油脂，也能在非水相反应体系中参与酯合成，转酯化，酸解等反应，被广泛的应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。不同于普通脂肪酶，偏甘油酯脂肪酶只能分解甘油二酯或甘油单酯，而不能分解甘油三酯，而其参与的酯化反应也只合成甘油二酯或甘油单酯。甘油二酯或甘油单酯具有良好的表面活性，目前被广泛应用于化妆品、食品、洗涤剂工业中。传统的生产甘油二酯或甘油单酯的工艺耗能大，向环境排放废弃物多，不利于环境保护，而利用酶法来制备甘油二酯或甘油单酯则具有更经济和环保的优点。文献报道的偏甘油酯脂肪酶数量较少，而目前只有来源于卡门柏青霉的一种偏甘油酯脂肪酶被商业化。前期，发明人从球形马拉色霉菌中分离了一种偏甘油酯脂肪酶SMG1，并应用于甘油二酯的合成。对该酶深入研究发现该脂肪酶是一种低温脂肪酶，具有结构稳定性不强的特点。高温会破坏蛋白构象而引起酶制剂活性的丧失。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的SMG1脂肪酶突变体。通过理性选择突变位点，是由马拉色霉菌属（Malassezia globosa）SMG1脂肪酶基因（genbank登录号XM_001732152.1），通过对其蛋白结构（PDB：3UUE）的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。进行定点饱和突变获得酶突变体，亲本SMG1氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为：Trp116Ala，Trp116His，Trp116Phe。

本发明的技术方案具体如下：

一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点饱和突变获得的酶突变体，其中突变位点为116位的Trp。

所述116位的Trp突变为Ala、His或Phe。

所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2、SEQ NO.3或SEQ NO.4。

利用上述突变体制备突变质粒的方法，包括如下步骤：

（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游片段，然后将带有突变位点基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；

（2）将上述扩增产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到突变质粒。

所述PCR的引物序列如下：

SMG For           5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’

3'AOX             5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’

Trp116His For     5’-GATGCGAAGTTCCATCAAGAAGAC-3’

Trp116His Rev     5’-GTCTTCTTGATGGAACTTCGCATC-3’

Trp116Phe For     5’-GATGCGAAGTTCTTCCAAGAAGAC-3’

Trp116Phe Rev     5’-GTCTTCTTGGAAGAACTTCGCATC-3’

Trp116ala For     5’-GATGCGAAGTTCGCGCAAGAAGAC-3’

Trp116ala Rev     5’-GTCTTCTTGCGCGAACTTCGCATC-3’

一种重组菌株的制备方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求4的含有突变体基因的质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；

（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博来霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。