[发明专利]EGFR基因19号外显子19种缺失突变检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术以及医学领域，尤其涉及一种人类EGFR基因19号外显子19种缺失突变的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生长因子受体）基因位于人类7号染色体短臂7p12～14区，由28个外显子组成，该蛋白属于受体酪氨酸激酶（TKI）家族。EGFR是一种跨膜蛋白，主要分布于细胞膜的表面，由细胞外配体结合域、跨膜区与细胞内酪氨酸激酶域三部分组成，其中18-24号外显子编码该基因的酪氨酸激酶结构域。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR通过与配体结合来激活，EGFR配体包括EGF和TGFα。EGFR与配体结合后发生二聚作用，引发酪氨酸残基的自磷酸化，从而激活其下游的3条主要信号通路：（1）Ras/Raf/MAPK通路；（2）PI3K/AKT通路；（3）JAK和STAT通路，这三条信号通路最终介导细胞分化、生存、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程,在肿瘤恶性生长中发挥重要作用。

EGFR信号通路重要靶标的检测及靶向治疗已是肿瘤个体化医疗领域关注的焦点，目前已开发出多种EGFR靶向药物。按照其作用机制，针对EGFR的靶向药物分为以下2种：1）作用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）；2）作用于EGFR胞外域部分的单克隆抗体（mAb），如西妥昔单抗（Cetuximab）、帕尼单抗（Vectibix）。其中EGFR-TKI在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）临床疗效明显，已被推荐为晚期患者的一线药物。

常用的EGFR-TKI包括吉非替尼（Gefitinib，又叫易瑞沙）和厄洛替尼（Erlotinib，又叫特罗凯），是目前NSCLC患者最有效的靶向药物。但EGFR-TKI并非对所有患者有效，EGFR敏感突变是药物有效的前提。临床研究结果表明，EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，吉非替尼有效率可达80%，而吉非替尼对于野生型患者基本无效；在对吉非替尼和厄洛替尼有反应的患者中EGFR突变率为77%，而对吉非替尼和厄洛替尼耐药的患者中突变率为7%。此外，研究表明部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者在后期会发生耐药反应，这与EGFR20号外显子的突变密切相关，其中50%的EGFR-TKI耐药由外显子20的T790M点突变所致。

研究发现，EGFR基因酪氨酸激酶区存在多种突变，主要集中在外显子18-21上，其中以19号外显子的缺失突变以及21号外显子L858R突变最为常见。EGFR基因19号外显子有19种常见缺失突变，这些突变发生在基因序列2235-2240bp处，分别缺失9～18bp序列，占该基因所有突变比率的45%（见表1）。

表1：EGFR基因19种缺失突变

研究发现，EGFR基因序列的这些突变与靶向药物吉非替尼和厄洛替尼的疗效显著相关，对于NSCLC患者选择用药的疗效预测有重要作用。美国FDA要求对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者进行EGFR基因突变检测。我国《非小细胞肺癌临床实践指南》中明确指出EGFR突变，尤其是19号外显子缺失突变与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的敏感度有重要关系。由此可见，对于EGFR基因19号外显子缺失突变的检测对于肿瘤个体化治疗显得十分重要。

目前针对基因突变的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM），荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测缺失突变效果较差，准确度不高。因此，需要建立一种快速有效的检测EGFR基因19号外显子缺失突变的方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种EGFR基因19号外显子19种缺失突变的检测试剂盒及其检测方法，旨在解决现有技术中针对此种缺失突变检测效果不理想的问题。