[发明专利]一种血管新生蛋白及其应用

权利要求书

1.一种促进血管新生蛋白，其特征在于命名为C1ql1-gl1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的促进血管新生蛋白，其特征在于：编码所述的C1ql1-gl1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的促进血管新生蛋白的制备方法，其特征在于由以下步骤实现：

（1）设计C1ql1-gl1蛋白的扩增引物，上游引物P5：5’-CAGAATTCACCTATACCACGGTGCCA-3’；下游引物P4：5’-CCGCTCGAGATCCGAGTAGATGATGAAGCCA-3’；上游引物P5含有EcoRI切割位点，下游引物P4含有Xho I切割位点，用于扩增引入EcoRI和Xho I酶切位点的C1ql1基因的球状结构域核苷酸序列；

（2）制备小鼠cDNA模板，采用Trizol试剂抽提小鼠脑部组织的总RNA，采用First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α-^TM合成cDNA一链；依此合成的cDNA一链为模板，以P5/P4引物进行PCR扩增；PCR扩增反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；得到特异扩增的引入EcoRI和Xho I酶切位点的C1ql1-gl1核苷酸序列的PCR扩增产物；

（3）将P5/P4扩增得到的引入EcoRI和Xho I酶切位点的C1ql1-gl1核苷酸序列的PCR扩增产物，通过EcoRI和Xho I两个酶位点，通过分别酶切、回收和连接后克隆到融合表达载体pET32a上，得到重组表达载体pET32a-C1ql1-gl1，通过测序确认引入序列正确；

（4）重组表达载体pET32a-gC1ql1-gl1中的外源片段gC1ql1-gl1与pET32a载体上的TRX标签融合表达融合蛋白TRX-C1ql1-gl1；将pET32a-gC1ql1-gl1转化大肠杆菌BL21（DE3）；挑取单菌落接种于含有100ng/ml氨卞的2×YT培养基中，37℃振摇培养过夜活化菌种，按照1:100的体积比接种到500ml的2×YT液体培养基，37℃放大培养至OD600为0.9时，加入IPTG至终浓度为1mM，18℃诱导培养24h后离心收集菌体；将总菌体用Tris缓冲液洗涤，再按照1g菌体用10ml的Tris缓冲液的比例将收集到的菌体悬浮，超声处理20min后，将超声后的上清液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析纯化，先用75mM的咪唑洗Ni²⁺柱，弃洗脱峰，然后直接用150mM的咪唑洗Ni²⁺柱，收集重组蛋白的洗脱峰，获得含融合蛋白TRX-C1ql1-gl1纯度较高的洗脱液；

（5）将融合蛋白TRX-C1ql1-gl1酶切纯化C1ql1-gl1蛋白；将步骤（4）获得的洗脱液过G25凝胶柱脱盐换酶切缓冲液，然后，在常温水浴中用重组肠激酶对融合蛋白TRX-C1ql1-gl1酶切过夜，酶切后的C1ql1-gl1蛋白溶液进行Ni²⁺Chelating Sepharose柱的再次上柱纯化去除TRX伴体；酶切后的样品在上柱时，TRX大部分吸附在Ni²⁺Chelating Sepharose柱上，C1ql1-gl1蛋白在穿流峰中，收集穿流峰；将收集的穿流峰溶液中的蛋白过Pierce High-Capacity Endoxin Removal Resin柱子去内毒素后获得纯化的无内毒素的纯度在95%以上的C1ql1-gl1蛋白，即制备获得了促进血管新生蛋白。

4.根据权利要求3所述的促进血管新生蛋白的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所用小鼠为KM小鼠，购自广东省实验动物中心。

5.根据权利要求3所述的促进血管新生蛋白的制备方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的Tris缓冲液为含50mM Tris·Cl,150mM NaCl，pH7.5；

步骤（4）中所述的超声处理的条件为300W，10s超声，10s间隔；

步骤（5）中所述的酶切缓冲液为20mM Tris·Cl，100mM NaCl，pH8.0。

6.权利要求1或2所述的促进血管新生蛋白的在制备组织器官缺血再灌注损伤的修复、心梗、脑梗、糖尿病引起的心脏病、动脉粥样硬化的治疗药物以及伤口愈合、器官移植过程中的药物开发中的应用。