[发明专利]以改性聚氯乙烯为载体的高活力固定化蛋白酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶领域，涉及一种以改性聚氯乙烯为载体的高活性固定化蛋白酶及其制备方法。具体为：对聚氯乙烯用乙二胺进行改性、再用戊二醛活化，以改性聚氯乙烯为载体，制备胰蛋白酶-糜蛋白酶的高活性固定化酶。

背景技术

蛋白酶在使用和储存期间易于发生自溶、解折叠和自聚效应，这些不稳定因素使其催化活性快速丧失，因而在一定程度上限制了其在工业化中的应用。通过将酶固定于不溶性载体而制备成固定化酶是酶工程学的一个重要分支。相比于游离蛋白酶，固定化蛋白酶在重复使用、稳定性和固液分离等方面具有显著优势。

要获得稳定而高活力的固定化蛋白酶，选择合适的载体和固定化方法显得尤为重要。聚氯乙烯（PVC）是一种独特的载体材料，具有多种优点，包括：价廉易得、化学惰性良好、坚韧、质量轻、免维护、耐水、耐腐蚀、强度-质量比高等特性。作为潜在的固定化酶载体，合适的官能团是使固定化技术能得以实现的必要因素，而聚氯乙烯的结构中没有任何功能性基团，因此需要用化学改性的方法引入适当的官能团。

胰蛋白酶和糜蛋白酶均属于丝氨酸蛋白酶，在蛋白酶消化中起重要作用，其结构和功能已被广泛研究，在医药及食品工业上也有着广泛的应用。不同的是，胰蛋白酶特异性水解精氨酸和赖氨酸残基的羧基侧的肽，糜蛋白酶特异性水解肽链中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基的羧基端肽。当这两种蛋白酶同时添加到蛋白溶液中时，比单一的蛋白酶水解过程具有更高的降解效率；两者的复合使用使得它们更加适合一些生物技术和食品加工应用。

目前，壳聚糖、聚丙烯酸酯、复合硅胶等是固定化蛋白酶的主要载体，且蛋白酶活性大都处于50-500U/g范围内。以改性聚氯乙烯作为载体的固定化蛋白酶及其技术尚鲜见报道；且目前的固定化酶技术通常是将某一种单一的酶固定于载体上，将两种蛋白酶进行复合并固定化的技术也极为少见，以胰蛋白酶和糜蛋白酶复合制备高活力固定化蛋白酶的技术也尚未见研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种以改性聚氯乙烯为载体的固定化复合蛋白酶及其制备方法。具体是通过如下技术方案实现的：通过乙二胺的氨基取代聚氯乙烯上的氯，引入氨基官能团；使用对称偶联剂戊二醛进一步活化胺化聚氯乙烯，将此改性聚氯乙烯作为固定化蛋白酶载体，对复合的胰蛋白酶和糜蛋白酶进行固定，制备成高活力固定化蛋白酶。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

1、聚氯乙烯的胺化：

按1﹕20（m﹕V）质量体积比向恒温搅拌反应器中加入聚氯乙烯粉末和乙二胺溶液（3%-5%体积分数），设置反应器温度为50℃-80℃，搅拌反应90min。反应结束后以蒸馏水洗涤胺化聚氯乙烯，以去除多余的乙二胺，30℃-50℃恒温干燥获得胺化聚氯乙烯粉末。

2、胺化聚氯乙烯的活化

按1﹕30（m﹕V）质量体积比向恒温搅拌反应器中加入胺化聚氯乙烯粉末和戊二醛溶液（2%-3%体积分数，6.0-8.0 pH值），设置反应器温度为50℃，搅拌反应45min。反应结束后以蒸馏水洗涤胺化聚氯乙烯，以去除多余的戊二醛。无需干燥，直接用于蛋白酶的固定化。

3、复合蛋白酶的固定化

以低盐缓冲液（6.0-8.0 pH值）和混合蛋白酶粉（胰蛋白酶、糜蛋白酶）配置混合蛋白酶酶液（2-3mg/mL质量体积比）。按1﹕10（m﹕V）质量体积比向恒温搅拌反应器中加入已活化的胺化聚氯乙烯和混合蛋白酶酶液。设置反应器温度为15-25℃，搅拌反应60-90min；搅拌反应完成后，4℃恒温放置6h，使改性聚氯乙烯与蛋白酶分子共价结合。固定化过程结束后，用蒸馏水和低盐缓冲液（7.0 pH值）各洗涤固定化蛋白酶1遍。真空冷冻干燥12h获得固定化混合蛋白酶粉末。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明通过上述方法制备固定化蛋白酶以聚氯乙烯为载体，聚氯乙烯颗粒价廉易得、安全无毒、具有化学惰性，适用于对安全要求较高的生物、食品等工程领域。相比其他载体材料，聚氯乙烯使得以本发明制备的固定化蛋白酶具有耐水、坚韧质轻的特点，从而有效扩大了固定化蛋白酶的适用范围。

以胰蛋白酶和糜蛋白酶复合制备固定化蛋白酶属于创新性技术。胰蛋白酶不但能催化蛋白质的水解，也是其他蛋白酶及蛋白酶原的激活物，能够促进糜蛋白酶活性和活化酶粉中的无活性蛋白酶原。使用胰蛋白酶和糜蛋白酶复合能极大的提高其蛋白酶解活性，以本发明制备的固定化混合蛋白酶粉末，其最高蛋白酶活力可达1310 ± 55U/g，是普通固定化蛋白酶的2.5-25倍。