[发明专利]利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种以带鱼为原料，通过复合酶水解带鱼蛋白质，利用超滤、亲和层析等技术制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的方法。

技术背景

带鱼又名刀鱼、牙带鱼，是鱼纲鲈形目带鱼科动物，是我国沿海产量较高的一种经济鱼类，味道鲜美，深受国内外消费者的青睐。带鱼蛋白质是一种全价蛋白质，含有人体必需的八种氨基酸，还含有钙、铁、磷、镁、锌、硒等微量元素以及多种维生素，营养丰富。中医认为带鱼具有和中开胃、暖胃补虚、润泽肌肤及美容等功效，并且对病后体虚、产后乳汁不足和外伤出血等症具有一定食疗作用。目前，带鱼的食用方法单一，主要是直接食用。然而，随着捕捞强度的增大，海洋捕捞的小带鱼产量呈逐年上升趋势；小带鱼由于体型小，直接食用的价值较低；现在主要用来生产鱼粉等低值产品，更有作为废弃物直接丢弃，导致资源未得到充分利用，经济效益低下，甚至污染环境。

糖尿病是一类严重威胁人类健康的疾病，我国2008年糖尿病患者约为4000万，II型糖尿病占93.7%，2025年预计将达到6000万。抗糖尿病药物的研究一直是受到关注的重要问题。二肽基肽酶IV（DPP-IV，EC3.4.14.5）已成为研究治疗糖尿病的新靶点。DPP-IV抑制剂通过竞争性结合DPP-IV活性部位，降低酶的催化活性，从而抑制胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖促胰岛素多肽（GIP）的降解，从而达到治疗糖尿病的目的。目前，通过化学合成的方法获得的DPP-IV抑制剂，如Sitagliptin、Vildagliptin，临床试验显示该类药物存在的问题是毒副作用较大，如血小板减少，腹泻，降低T细胞的活性，影响机体免疫功能等；而从天然产物中获取DPP-IV抑制剂正在成为新的研究方向。天然海洋蛋白质，基于生长环境的特异性，其多肽链中存在功能、结构新颖的活性片段；采用酶工程的技术手段水解蛋白质已成为制备生物活性肽的一种重要方法。生物活性肽的活性与其结构密切相关，而结构取决于氨基酸序列和分子量大小。一般来说，分子量低于3000Da的肽类具有更高的生物活性。

目前，尚还未有人通过酶解带鱼蛋白质制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的报道。由于带鱼蛋白水解液中DPP-IV抑制肽的含量较低，其分离制备颇为艰难，因而建立和发展微量水平上DPP-IV抑制肽的分离制备新方法是本发明要解决的关键问题。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种以带鱼为原料，制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的方法，制备步骤包括：

（1）将带鱼去头、尾和内脏，洗净称重，加入1～3倍带鱼质量的水，绞碎成均匀的鱼肉浆；

（2）将步骤（1）制备的鱼肉浆放入酶解罐中，添加带鱼质量0.1%～1.0%的内切蛋白酶，调温至40～70℃，调pH至5.0～8.5，搅拌水解4～12h，得水解液；

（3）搅拌水解结束后，升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；

（4）将步骤（3）灭酶后的水解液冷却至40～60℃，添加带鱼质量0.1%～1.0%的外切蛋白酶，调pH至5.0～7.5，搅拌水解2～8h；

（5）搅拌水解结束后，升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；

（6）将步骤（5）所得灭酶后的水解液离心：3600～4000rpm、1～5℃、10～15分钟，取上清液；

（7）将步骤（6）的上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；

（8）采用亲和层析方法分离纯化DPP-IV抑制肽；将二肽基肽酶IV固定化在CNBr-activated Sepharose4Fast Flow层析介质上；层析介质装柱后将层析柱用缓冲液平衡2～6柱体积（CV），然后将步骤（7）收集的滤膜透过液即超滤液上柱，采用缓冲液清洗2～5柱体积，然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜(8-24h)；

（9）将透析后的溶液在-20～-24℃预冻16～24h，然后在-60～-65℃、0.005～0.0054毫巴（mbar）冷冻干燥25～36h，即得到二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽。

本发明上述的带鱼质量均以步骤（1）去头、尾和内脏，洗净称重后的带鱼质量计算。