[发明专利]一种体外构建三维立体组织的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种组织工程技术领域，尤其涉及一种体外构建三维立体组织的方法，以及该方法构建的三维立体组织。

背景技术

先天性或获得性尿道疾病的手术修复是泌尿外科领域不断探索的难题之一。组织工程技术的发展为尿道狭窄的修复提供了新的理念。其中脱细胞基质作为细胞再生的支架是组织工程的一个重要内容。目前对于脱细胞基质研究最多的为小肠黏膜下脱细胞基质（SIS），并应用于临床尿道修复，已取得较好效果。

小肠黏膜下脱细胞基质是一种取材于猪小肠的异体组织，制作时去除小肠的黏膜层、浆膜层以及肌层，从而形成厚0.1cm的膜状组织，其中含有胶原成分以及一些促进组织再生的生长因子，并且其与细胞外基质十分接近，而有利于细胞的粘附和生长，最大优点是没有免疫原性。以往研究已证实其可作为一种良好的支架材料促进尿道修补处的上皮再生以及新生血管的形成，目前已作为一种产业化的成品。利用SIS进行尿道修复重建时可以明显缩短手术时间并可避免自体取的一些并发症（Yue-Min Xu,Qiang Fu,Ying-Long Sa,JiongZhang,Lu-Jie Song,Chao Feng.International Journal of Urology，2013,20:622-629）。

目前常选择4层交迭SIS作为支架。但是4层SIS支架目前修复长段尿道缺损效果不理想，究其原因为单纯的长段SIS在体内不能保证充足的血供，且新生血管不能快速形成。而将种子细胞在体外与支架复合能够促进新生血管的快速形成（H Orabi,T AbouShwareb,Y Zhang,JJ.Yoo,A Atala.Cell-Seeded Tubularized Scaffolds for Reconstruction of Long Urethral Defects:A Preclinical Study.2013,63,531–538）。

而对于应用于尿道组织工程的种子细胞，传统最常见的是采用尿路上皮细胞和平滑肌细胞，但是这种种子细胞的获取常常需要膀胱活检或切开获得，取材方式比较不方便。而干细胞作为种子细胞存在肿瘤形成或血管瘤等严重并发症。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种体外构建三维立体组织的方法。

本发明提供了一种体外构建三维立体组织的方法，包括以下步骤：

步骤1，分离培养上皮细胞和肌细胞；

步骤2，将小肠黏膜下层脱细胞基质支架置入肌细胞悬液中，震荡复合完成后，继续培养；

步骤3，将上皮细胞悬液滴在经步骤2处理得到后的支架的肌细胞层上，继续培养得到三维立体组织。

其中，所述肌细胞可以为人体的各种肌细胞，例如骨骼肌细胞、平滑肌细胞或心肌细胞等，优选为骨骼肌细胞。

其中，所述上皮细胞可以为人体各个部位的上皮细胞，例如口腔、喉部、鼻咽、器官、肺、胃、肠等的上皮细胞，优选为舌上皮细胞。

优选地，所述三维立体组织为三维立体尿道组织。

优选地，步骤2中的震荡复合在恒温震荡箱内进行，温度为25-40℃（优选30-39℃，更优选33-38℃，更优选35-37℃），速度为50-150rpm/min（优选60-120rpm/min，更优选70-110rpm/min，更优选75-95rpm/min），持续震荡6-24h（优选7-20h，更优选8-16h，更优选10-14h）。

优选地，步骤2中所述肌细胞悬液由步骤1得到的肌细胞消化调整密度为（0.5-5）×10⁷/mL得到，其中，密度更优选为（0.8-4）×10⁷/mL，更优选为（1-3）×10⁷/mL，更优选为（1.5-2.5）×10⁷/mL。

优选地，步骤3中所述上皮细胞悬液由步骤1得到的上皮细胞消化调整密度为（0.2-3）×10⁶/mL得到，其中，密度更优选为（0.4-2.5）×10⁶/mL，更优选为（0.6-2.2）×10⁶/mL，更优选为（0.8-1.6）×10⁶/mL，更优选为（0.9-1.2）×10⁶/mL。

优选地，步骤2中继续培养时间为2-6d，每天换液。

优选地，步骤3中继续培养时间为2-6d，每天换液。

优选地，步骤2中所述小肠黏膜下层脱细胞基质支架在使用前先进行消毒处理。