[发明专利]用于绵羊痘病毒检测的E3蛋白及其高免血清

说明书

技术领域

本发明涉及一种绵羊痘病毒的蛋白及其高免血清，以及该蛋白和高免血清的所有用途。确切讲本专利涉及用于绵羊痘病毒检测的E3蛋白及其高免血清，以及这一蛋白及其高免血清的用途。

背景技术

绵羊痘是绵羊疫病中一种高度接触性和具有毁灭性病毒病，被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告的动物疫病，以发热、结膜炎、鼻炎、皮肤和粘膜的痘疮、呼吸困难及死亡为特征。绵羊痘主要流行于非洲、中东、印度、尼泊尔土耳其的一些地区，国内主要流行于青海、甘肃、湖南和内蒙等地区。绵羊痘病毒（Sheeppox virus, SPPV）属于痘病毒科、脊索动物痘病毒亚科、山羊痘病毒属，主要通过气溶胶、近距离接触或昆虫叮咬传播，绵羊是绵羊痘病毒主要的宿主，各年龄段均能感染，但是死亡病例主要发生于羔羊，死亡率高达100%，给养羊业造成重大的经济损失，被认为是经济上潜在的生物武器。因此，绵羊痘的诊断和防控一直是研究的热点。

发明内容

本发明提供一种用于检测绵羊痘病毒的E3蛋白及在基础研究中检测E3蛋白的高免血清。

本发明的重组E3蛋白的制备方法是：分别采用SEQ ID 1和SEQ ID 2的序列为上下游引物，以绵羊痘病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增获得SPPV E3L基因，与pMD18-T simple载体连接后，再将连接产物转化至DH5α感受态细胞，提取质粒并测序，将测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-SPPV E3L。将SPPV E3L基因亚克隆至原核表达载体pGEX4T-1中，重组质粒命名为pGEX4T-1-SPPV E3L，再将重组质粒转化至BL21（DE3）plysS感受态细胞中，以IPTG为诱导剂对重组菌进行诱导表达，得到重组E3蛋白。

本发明所制备的重组E3蛋白在可绵羊痘病毒检测中的应用，也可在制备绵羊痘病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

利用本发明的重组E3蛋白对小鼠进行免疫后，采取二免血样经分离后可得到免疫血清。

本发明所得到的免疫血清可在绵羊痘病毒检测中的应用，也可在制备绵羊痘病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

痘苗病毒是痘病毒科重要的成员，是研究痘病毒的模式病毒。E3 蛋白是痘苗病毒（VV）重要的免疫逃避因子，是由E3L 基因编码的早期非结构蛋白，由位于氨基末端的 Z-DNA 结合域（ZDBD）和位于羧基末端的 dsRNA 结合域（DRBD）构成，能够通过阻断病毒感染过程中产生的 dsRNA 抑制 PKR和OAS的活化，使感染细胞内的翻译反应顺利进行，为病毒的复制提供了合适的微环境。绵羊痘病毒全基因组测序发现，第34号开放阅读框编码与E3蛋白同源的蛋白，推测是绵羊痘病毒潜在的致病因子，因此，对绵羊痘病毒E3蛋白的研究能够为阐明其致病机理奠定基础。

迄今为止，绵羊痘病毒E3蛋白的研究尚属空白。本发明的研究表明，绵羊痘病毒E3蛋白具有很好的免疫原活性，能够作为检测绵羊痘病毒感染的候选蛋白。通过分子生物学及基因工程手段优化其密码子后，本发明以大肠杆菌为宿主细胞首次表达并纯化出具有生物学活性的绵羊痘病毒E3蛋白，并将该蛋白免疫BALB/c小鼠，制备高免血清。间接ELISA检测结果表明，制备的高免血清具有很高的血清效价。本发明制备的绵羊痘病毒E3蛋白及其高免血清在绵羊痘病毒的抗体检测以及免疫学检测中具有很高的价值。

附图说明    

图1为SPPV E3L基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，图中：

M：DNA分子质量标准；1：SPPV E3L基因的扩增产物。

图2为SPPV E3L基因的T-A克隆酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，图中：

M：DNA分子质量标准；1：重组质粒pMD18-SPPV E3L的BamHⅠ+XhoⅠ双酶切产物；2：重组质粒pMD18-SPPV E3L。

图3为重组表达载体pGEX4T-1-SPPV E3L酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，图中：

M：DNA分子质量标准；1：重组质粒pGEX4T-1-SPPV E3L；2：重组质粒pGEX4T-1-SPPV E3L的BamHⅠ+XhoⅠ双酶切产物。

图4为重组蛋白SPPV E3诱导后的SDS-PAGE电泳图，图中：