[发明专利]生产D-乳酸的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产D‑乳酸的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的ldhA基因的大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产D‑乳酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产D‑乳酸的方法。在本发明生产D‑乳酸的方法中，可以在高温下(42‑50℃)进行发酵。在本发明生产D‑乳酸的方法中，可以在发酵过程中使用氨水或者氢氧化钠作为中和剂。

发明领域

本发明涉及通过大肠杆菌发酵生产D-乳酸的领域。具体而言，本发明提供了一种用于生产D-乳酸的经工程化的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述经工程化的重组大肠杆菌用于生产D-乳酸的用途，及使用所述经工程化的重组大肠杆菌生产D-乳酸的方法。

发明背景

D-乳酸为手性小分子，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、化工等方面的应用十分广泛。以D-乳酸为原料合成的D-聚乳酸，具有生物可降解性，是理想的绿色高分子材料：可代替由聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生产新型环保包装材料；可代替硅橡胶、硅油等传统的医用材料制作骨内固定物和医用手术缝合线等医用材料；用于纺织行业，制成手感好、滑爽性强并富有光泽的内衣；以D-乳酸为原料合成乳酸酯类用于香料、树脂涂料、胶黏剂及印刷油墨等的生产；用于制造优良除草剂：骠马（Puma Super）、威霸（WhipSuper；德国Hoechst公司）、DuplosanR（德国BASF公司）。

D-乳酸的制备方法主要有手性拆分法、酶转化法和直接发酵法。由于手性拆分法和酶转化法存在污染环境，成本昂贵等问题，目前D-乳酸的大规模化生产大多采用微生物发酵法。微生物发酵法生产D-乳酸，以其生产成本低，产品安全性高，成为大规模生产D-乳酸的主要方法。生产高光学纯度的D-乳酸是微生物发酵法的主要制约因素。

目前乳酸发酵菌株主要有两大类。第一类是天然产乳酸菌，主要是乳酸芽孢杆菌(Lactobacillus)，由于具有耐酸性强，遗传改造后能生产高光学纯度的D-乳酸，因此是重要的商业化菌株(Demirici et al.1992,J Indust Microbiol Biotechnol11:23-28;Okano K et al 2009,Appl Environ Microbiol 75:462-467)。该生产菌的缺点是发酵过程需要丰富培养基，不能利用五碳糖，提高了生产成本和下游分离纯化的成本。该类菌通常使用氢氧化钙或碳酸钙作为中和剂来控制发酵pH，最终的发酵产物是乳酸钙。然而，乳酸钙在分离提取的过程中通常需要加入硫酸，会产生大量的硫酸钙废物，难以处理。更重要的是，该类菌生产的D-乳酸手性纯度通常都在98%以下，达不到聚乳酸生产的要求。

另一类是通过代谢工程改造的工程菌，有酵母菌(Saccharomyces)，芽孢杆 菌(Bacillus)，克氏菌(Kluyveromyces)和大肠杆菌(Escherichia)。这些改造的菌株都在某些方面提高了乳酸生产的性能如扩大了底物利用的范围，减少了营养需求，或减少了质粒或抗生素的使用等(Bianchi et al.2001,Appl Environ Microbiol67:5621-5625;Grabaret al.2006,Biotechnol Lett 28:1527-153;Stewart et al.2013,Yeast 30:81-91)。在微生物发酵生产中，大肠杆菌(E.coli)由于其遗传背景清楚、易操作、易调控、易培养、生长迅速、能够利用多种碳源及能以简单的无机盐培养基培养等优点，被广泛用于研究以获得高产菌株。大肠杆菌在缺氧条件下，通常消耗糖或其衍生物，并发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇等产物。野生型大肠杆菌生产乳酸等的产率通常较低。近年来的研究表明，对大肠杆菌的代谢途径进行遗传改造，可以获得乳酸高产菌株。同时改造大肠杆菌细胞使其能够生产高光学纯度的D-乳酸是目前研究的重点和热点。