[发明专利]斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种CCCTC结合因子基因功能缺失斑马鱼在造血缺陷方面的研究模型建立及应用。

背景技术

斑马鱼作为一个脊椎动物造血模型，既优于其它的动物模型，又与哺乳类造血具有高度保守性。斑马鱼造血系统的发生分为两波，原始造血和定向造血。原始造血产生一过性细胞群，主要是红细胞和一些髓系细胞，而定向造血产生能自我更新的造血干细胞，这些细胞生成所有造血系，包括淋巴细胞。在斑马鱼中，原始造血起源于两个胚外造血位点，前部侧板中胚层和尾部侧板中胚层，继而形成中间细胞团。前部侧板中胚层是原始巨噬细胞的初始位点，中间细胞团是多潜力血液祖细胞产生位点，主要产生红细胞和一些粒细胞。24hpf(受精后时间(小时))循环开始后，一过性的红髓祖细胞在后部血岛形成。定向造血出现于30hpf，这时造血干细胞在背部动脉内壁形成，这是一个类似于哺乳动物大血管-性腺-中肾的区域。随后干细胞迁移至尾部造血组织，从那里移于肾脏和胸腺。造血干细胞是唯一能产生髓红血小板和淋系的细胞，被认为维持成体造血，在成鱼的肾髓中。

CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC结合因子)是广泛存在于真核生物的多功能转录因子。其N端11个锌指结构可以形成不同的组合，使CTCF调控多种靶基因的表达。基于它的能力是结合大范围的不同序列，与特异的共调节蛋白通过不同锌指组合，ctcf起初被描述为多价因子。这一特异的结构提供了第一个线索，暗示其区别于大部分锌指在基因组调节中的功能。一系列的证据表明了ctcf在不同细胞过程的关键作用。Ctcf纯合敲除小鼠展现了早期胚胎着床前致死表型。母源性敲除卵母细胞中ctcf明显破坏了正常的进行囊胚阶段。目前的研究谱系绘制了基因组范围的占据，分布谱式在多细胞类型，进一步强化了概念，即细胞下游的影响是ctcf在基因组调控的结果。使用chip-seq，在人CD4+T细胞中发现了20,262个ctcf潜在的基因结合位点。然而，其对造血的影响还需要较好的模型研究予以阐明并应用于医药研究。

发明内容

本发明的目的在于提供斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用。

在本发明的第一方面，提供CCCTC结合因子下调剂的用途，用于制备构建斑马鱼造血干细胞缺陷模型的试剂。

在一个优选例中，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种CCCTC结合因子下调剂，其是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法，所述方法包括：在斑马鱼中下调CCCTC结合因子的表达(包括使之不表达)，从而获得斑马鱼造血干细胞缺陷模型；较佳地，通过化学诱变、基因定点突变及morpholine敲除下调CCCTC结合因子的表达。

在一个优选例中，所述的制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法中，应用所述的CCCTC结合因子下调剂来制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型。

在本发明的另一方面，提供一种斑马鱼模型，其中CCCTC结合因子不表达或低表达；如表达量仅为野生型正常斑马鱼的20%或更低。

在本发明的另一方面，提供一种筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物的方法，所述方法包括：

(1)提供斑马鱼CCCTC结合因子突变型(纯合体)胚胎；

(2)按照受精后时间计算，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；

(3)药物处理后(较佳地为处理24-48小时后)，检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位；

其中，若runx1和/或cmyb表达显著提高(如提高20%；更佳地提高40%；更佳地提高60%)，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。

在一个优选例中，应用原位杂交技术检测runx1和/或cmyb的表达和定位。

在另一优选两种，所述的筛选方法中，步骤(2)包括：在测试组中，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；和/或

步骤(3)包括：检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位，并与对照组比较，其中所述的对照组是不用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼CCCTC结合因子突变型(纯合体)胚胎；

若与对照组相比，测试组runx1和/或cmyb表达显著提高(如提高20%；更佳地提高40%；更佳地提高60%或更高)，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。