[发明专利]检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、抗牛IgG酶标二抗、洗涤液、稀释液、封闭液、底物液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板是用氨基酸序列是SEQ ID No.2的牛分枝杆菌抗原包被固相载体得到的。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述包被酶标板按照包括如下步骤的方法制备：将氨基酸序列是SEQ ID No.2的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板。

3.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：每升所述包被缓冲液按照如下方法配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。

4.根据权利要求1至3中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQ ID No.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a（+）中的EcoR I和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。

6.根据权利要求1至5中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗牛IgG酶标二抗是以辣根过氧化物酶标记的羊抗牛IgG；

所述阴性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阴性牛的血清；

所述阳性标准血清是经牛结核菌素皮内变态反应检测和γ-干扰素ELISA检测均为牛分枝杆菌阳性牛的血清；

所述洗涤液是含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；每升所述含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液由NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O2.9g，吐温-20500uL，加蒸水定容至1000mL，调pH值到7.4制成；

所述稀释液是1%BSA溶液；

所述封闭液是5%脱脂奶粉溶液；

所述底物液是TMB-H₂O₂溶液；每升所述TMB-H₂O₂溶液由TMB缓冲液10ml、TMB溶液0.5ml、H₂O₂32ul组成；所述TMB缓冲液由Na₂HPO₄18.27g，柠檬酸4.665g，用900mL溶解，调pH至5.5，加水至1000mL制成；所述TMB溶液由5mL无水乙醇溶解TMB10mg制成；

所述终止液是2M H₂SO₄溶液。

7.制备检测牛分枝杆菌抗体的酶联免疫试剂盒的方法，包括如下制备包被酶标板的步骤：将氨基酸序列是SEQ ID No.1的牛分枝杆菌抗原用包被缓冲液配制成8μg/mL的溶液作为包被液加入固相载体中，37℃温育1h后，在4℃放置8-10小时；然后对所述固相载体进行封闭得到包被酶标板。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：每升所述包被缓冲液按照如下方法配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加水定容至1000mL，调pH值到9.6。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述牛分枝杆菌抗原是将编码序列是SEQ ID No.1的第32-334位核苷酸所示的DNA分子在大肠杆菌中表达得到的蛋白质。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述DNA分子通过重组表达载体pET32a-MBA导入所述大肠杆菌，所述重组表达载体pET32a-MBA是将pET32a（+）中的EcoR I和HindⅢ识别位点间的小片段替换为所述DNA分子得到的重组表达载体。